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第一部分JUP对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨在胃癌细胞中敲低或过表达JUP对胃癌细胞生物学行为及功能的影响。方法:通过sh RNA干扰慢病毒及包装的过表达质粒介导的慢病毒手段构建敲低、过表达JUP基因的慢病毒载体序列及其各自阴性对照病毒。转染至人胃癌NUGC-3、MGC-803细胞中,建立JUP基因沉默、及JUP过表达的稳定细胞株,通过Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)和Western blot验证JUP在mRNA及蛋白水平上的沉默及过表达情况;利用CCK-8、细胞划痕愈合实验(Wound healing)和Transwell小室实验检测各稳定敲低或过表达细胞株的增殖、迁移以及侵袭能力的变化。结果:成功构建稳定敲低JUP的NUGC-3、MGC-803细胞株,过表达JUP的NUGC-3、MGC-803细胞稳定株及其各自对照细胞株;与对照组比较,敲低JUP之后对胃癌细胞的增殖能力没有显著影响;划痕愈合实验和Transwell小室实验表明在NUGC-3细胞中可促进细胞的迁移侵袭能力,然而在MGC-803细胞中可抑制细胞的迁移和侵袭能力;在NUGC-3和MGC-803细胞中过表达JUP之后可明显抑制细胞的迁移和侵袭能力。结论:在胃癌细胞中,沉默JUP,胃癌细胞的增殖能力没有明显变化;JUP定位于细胞膜或细胞浆存在高表达的胃癌细胞,JUP沉默胃癌细胞的迁移侵袭能力明显增强;JUP定位于细胞核且高表达的胃癌细胞,JUP沉默则癌细胞的迁移和侵袭能力明显降低;向胃癌细胞外源性导入JUP,可降低胃癌细胞的迁移侵袭能力。第二部分JUP对胃癌细胞侵袭影响分子机制研究目的:探讨沉默及过表达JUP对胃癌细胞迁移侵袭影响的具体分子生物机制。方法:q RT-PCR和Western blot检测JUP敲低的NCL-87细胞(JUP定位于细胞膜),EMT相关marker的表达变化;免疫荧光检测NCL-87,NUGC-3,MGC-803细胞中敲低JUP及NUGC-3,MGC-803细胞中过表达JUP之后,b-catenin的分布及表达量;Western blot检测以上各细胞株中p-b-catenin,n-b-catenin,T-b-catenin及MMP7表达量的变化;利用生物信息分析蛋白相互作用(https://string-db.org/)及结合我们前期的LC-MS/MS数据,找到与JUP相互作用的蛋白;利用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析JUP与相互作用蛋白的皮尔森相关系数;免疫荧光共定位及Co-IP检测JUP与相互作用蛋白的互作关系;Western blot检测p-EGFR,T-EGFR,p-AKT,T-AKT,p-GSK3b及T-GSK3b表达变化情况。结果:在NCL-87细胞中敲低JUP,细胞形态从上皮样转变为间质梭型细胞样,上皮标志物E-cadherin表达降低,间皮标志物Vimentin表达升高;在NCL-87,NUGC-3(JUP定位于细胞质)细胞中敲低JUP,p-b-catenin表达降低,n-b-catenin及T-b-catenin表达升高,MMP7表达升高;MGC-803细胞(JUP主要定位于细胞核)中敲低JUP,p-b-catenin表达升高,n-b-catenin及T-b-catenin表达降低,MMP7表达降低;NUGC-3,MGC-803细胞过表达JUP,p-b-catenin表达升高,n-b-catenin及T-b-catenin表达降低,MMP7表达降低。蛋白相互作用网络找到12个与JUP存在直接或间接相互作用的蛋白;皮尔森相关系数表明EGFR与JUP有密切相关性;Co-IP证明JUP与EGFR的互作关系,免疫荧光共定位证实JUP与EGFR共定位在细胞膜上;NCL-87细胞敲低JUP,p-EGFR、p-AKT、p-GSK3b表达升高;NUGC-3、MGC-803过表达JUP,p-EGFR、p-AKT、p-GSK3b表达降低。结论:JUP定位于细胞膜或细胞浆的胃癌细胞(NCL-87、NUGC-3),敲低JUP表达,可以活化EGFR/AKT/GSK3?信号通路,从而使p-?-catenin表达降低,?-catenin转位到细胞核,促进其下游靶基因MMP7的表达,从而使细胞的迁移侵袭能力增强及EMT转化;相反,在胃癌NUGC-3,MGC-803细胞中过表达JUP,抑制了EGFR/AKT/GSK3?信号通路,?-catenin泛素化降解增加,MMP7表达降低,细胞的迁移侵袭能力相应减弱。