为了证明三拷贝C3d的免疫负调控作用,该课题分别选择hCGβ、HER-2/neu、HBV-preS2/S作为模式抗原,设计相应的基因疫苗,通过基因免疫手段免疫小鼠以观察C3d对特异性免疫应答的调节作用,并探讨其可能的机制.第一部分C3d的免疫负调控现象在以前的研究中我们曾发现C3d抑制hCGβ诱导的体液免疫应答,为确证C3d对hCGβ免疫应答的负调控作用,我们进行了该部分研究.采用酶切法获得hCGβ链的编码基因(513bp),定向克隆入TR421和TR421-C3d3质粒,获得hCGβ的真核表达载体TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3重组质粒.为观察hCGβ基因疫苗在真核细胞内的表达,用脂质体法将TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3质粒转染人肝癌细胞系-7721细胞.放射免疫法检测细胞培养上清发现:重组质粒TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3可在真核细胞中表达hCGβ,而TR421-hCGβ-C3d3质粒在真核细胞中表达hCGβ的量明显低于TR421-hCGβ组.在此研究基础上我们探讨了C3d对hCGβ基因疫苗诱生的特异性体液免疫应答的调节作用.以100μg TR421、TR421-hCGβ及TR421-hCGβ-C3d3免疫雌性BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗-hCGβ-IgG抗体,结果显示所有TR421-hCGβ质粒基因免疫小鼠能够诱导高水平的抗-hCGβ-IgG特异性抗体,而TR421-hCGβ-C3d3质粒免疫小鼠诱导的抗体水平较低,两组相比有显著性差异(P<0.001),提示C3d可抑制hCGβ抗体应答.为了排除我们所用的系统对C3d免疫负调控作用的影响,我们又选择HBV-preS2/S作为模式抗原,分别构建了TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3.通过RT-PCR检测HBV基因疫苗在真核细胞内mRNA的表达水平,结果显示preS2/S-C3d3融合蛋白的表达比preS2/S的表达低.在此基础上,我们以TR421、TR421-preS2/S和TR421-preS2/S-C3d3免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗-HBs-IgG抗体,结果发现TR421-preS2/S重组质粒能诱导小鼠产生特异性抗-HBs-IgG,而TR421-preS2/S-C3d3重组质粒诱导了更高水平的特异性抗-HBs-IgG,两者相比有显著性差异(P<0.05),提示C3d可显著增强基因免疫诱导的HBV特异性体液免疫应答.第二部分C3d免疫负调控作用的再确立鉴于hCGβ是一种癌胚抗原,我们设想是否还存在C3d对其他癌胚抗原的负调控作用,因而我们选择了另外一种癌胚抗原-HER-2/neu,进行了该部分研究.通过酶切获得HER-2/neu胞外区的编码基因hECD,定向克隆入TR421和TR421-C3d3质粒,获得hECD的真核表达载体TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3重组质粒.通过免疫组化方法检测了TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3在体内的表达情况,结果显示TR421-hECD、TR421-hECD-C3d3在注射肌肉局部有显色,而TR421注射肌肉局部无显色,证实TR421-hECD及TR421-hECD-C3d3可在体内有效表达.在此基础上探讨了C3d对HER-2/neu基因疫苗诱生的特异性体液免疫应答的调节作用.第三部分C3d免疫负调控作用的可能机制在前两部分的研究中我们相继证明了三拷贝C3d负调控基因免疫诱导的hCGβ、HER-2/neu特异性免疫应答,但可以增强基因免疫诱导的HBV特异性免疫应答,分析可能的原因:一是抗原性的差异导致了C3d不同的调节作用;另一方面CD21-CD19在B细胞对补体—抗原复合物的提呈过程中起着重要作用,C3d可能影响了B细胞对癌胚抗原的抗原提呈,从而导致了C3d的负调控;另外,IL-4在CD21增强B细胞活化中也起着重要作用.我们以hCGβ为模式抗原研究了C3d免疫负调控作用的可能机制.为了检测C3d对B细胞和巨噬细胞对hCGβ抗原提呈的影响,我们分别用hCGβ、hCGβ-C3d3与B细胞、巨噬细胞共孵育,灭活,然后与不同质粒免疫小鼠脾细胞按一定效靶比共孵育,检测CPM值发现:巨噬细胞对hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,在TR421-hCGβ、TR421-hCGβ-C3d3重组质粒免疫小鼠脾细胞,SI没有明显差异(P>0.05),提示C3d不影响巨噬细胞对hCGβ的提呈;至于B淋巴细胞对hCGβ和hCGβ-C3d3的提呈,TR421-hCGβ-C3d3免疫组的SI都显著低于TR421-hCGβ(P<0.05),提示C3d负调控了B淋巴细胞对hCGβ的提呈.在此基础上我们研究了C3d对脾细胞中参与T细胞分化的重要转录因子和产生的细胞因子表达的影响.