食草动物自身不能产生纤维素酶和半纤维素酶,但是其瘤胃内有非常丰富的微生物,这些微生物则能分泌分解植物纤维的酶类,分泌的纤维素酶与半纤维素酶可以帮助食草动物消化植物纤维获得自身需要的能量与物质。反刍动物在进食纤维素食物时,一些植物蛋白等外源蛋白随之进入动物体内。外源蛋白先到达瘤胃,被微生物降解生成并利用氨,保证生命活动的需要,其余被瘤胃吸收,经过循环或是被瘤胃再利用,或是由肾脏排出体外,可见瘤胃中蛋白质的降解对瘤胃内微生物群体自身群体的稳定发挥着很重要作用。与纤维素酶和半纤维素酶的深入研究相比,瘤胃中蛋白酶的研究相对较少。实验室前期已经建立了山羊瘤胃的宏基因组文库,在用脱脂牛奶的平板上筛选得到2个阳性克隆：R-P-1和R-P-2。通过测序和基因注释发现,R-P-1只有一个蛋白酶(1SP)基因；R-P-2中有3完整的蛋白酶(2SP1、2SP2、2SP3)基因和一个不完整的蛋白酶(2SP4)基因,此外还有1个金属肽酶(2P)基因。这5个蛋白酶是丝氨酸蛋白酶,属于S8家族；金属肽酶属于M48家族,Zn2+依赖型。在上述的基础上,我们对上述4个完整的蛋白酶序列在蛋白数据中重新比对,发现R-P-1中的1SP蛋白酶和R-P-2中前3个蛋白酶和金属肽酶都与反刍杆菌属的一些功能未知假定蛋白的一致性最高。对蛋白酶的结构域分析,发现这4个蛋白酶均有典型S8家族的结构域,且在结构域的前后均有很长功能未知的N端和C端序列。蛋白序列的二级结构预测分析,蛋白酶的无序状态比例较高,而2P的α-螺旋的比例较高。I-TASSER工具模建三级结构,只有2SP3和2P可以形成典型的球状结构,1SP、2SP1、2SP2在球形结构的同时,N端伸出较长的臂。我们首先通过硫酸铵分级沉淀R-P-1的胞外蛋白,强阴离子交换层析或再加凝胶过滤层析分离1SP。但是由于R-P-1产生的1SP太少,分离过程中损失的太多,这套方法未能分离到1SP蛋白。在大肠杆菌胞内表达了可溶性、表达量可观的2P,但是多种方法没能检测酶活性,我们猜测其原因可能是2P催化位点发生了突变,导致活性丧失。以大肠杆菌为宿主,胞外表达了有活性的2SP3、胞内表达了2SP3包涵体。经初步分离和LC-MS/MS确定了有活性的2SP3是其基因的全长表达,发现2SP3的C端对蛋白稳定性和活性都很重要。由于2SP3活性表达量太少及包涵体复性率太低对我们获得大量的2SP3造成很大的困难。