第一部分 人HuR蛋白在肾小管上皮细胞EMT过程中的作用研究背景近年来,由于亚洲地区糖尿病人群基数持续增多,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)逐渐成为终末期肾脏疾病(End stage renal disease, ESRD)最常见的原因之一。根据美国肾脏病数据库(USRDS)的统计,美国人群的糖尿病肾病发病率近年来维持在较稳定的水平,可能是由于血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI或ARB)类药物的广泛使用,但是进展至ESRD的速度却丝毫没有放缓。由于国情不同以及发病机制的复杂性,各种作用相互交织,其病因以及发病机制尚未完全阐明,最终均以不可逆的肾脏纤维化进展至尿毒症为结局。上皮细胞间充质转化现象(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)的发生与特定环境下某些生物学特征的改变密切有关,外部环境发生改变时,人体内特定程序将随之发生转化,使某些上皮细胞转化为具有间质表型的间质细胞,其生物学效应也多种多样,如在纤维化疾病,慢性炎症过程,癌症异位转移,胚胎的发育以及组织重构等等都发挥了重要作用。因为发生EMT过程中步骤繁多却十分有序,其过程可以在某种程度上受到外界的高度调节,同时产生多种致病因子,反之,许多生长因子或致纤维化因子均能诱导其发生。RNA结合蛋白HuR是胚胎致死异常视觉家族(ELAV)中的一员,在许多疾病中广泛表达,由于其在肿瘤和炎症中的地位和作用得到更多关注。研究表明HuR与肿瘤发生过程中的许多特征密切相关,如原癌基因的激活,细胞周期调控失控导致的细胞不良增殖,细胞外基质成分和各种致纤维化因子的异常增多,最终导致了器官纤维化。而在EMT的发生发展中同样存在如间充质基因的激活,细胞的异常增殖,生长因子的过分增多等特征。本研究将通过HuR蛋白与糖尿病肾病EMT特征的关系来探讨转录后调控糖尿病肾病中的作用,从而阐明HuR蛋白极可能是影响EMT发展以及糖尿病肾病进展的重要因素。研究方法(1)选取病理诊断为糖尿病肾病的肾脏病理组织20例,正常肾脏组织10例。入院后所有患者签署肾穿刺活检知情同意书,并经过山东大学附属省立医院伦理委员会批准。同时,选取雄性SD大鼠,分为正常组和糖尿病肾病组,使用链脲佐菌素(STZ)方法建立糖尿病肾病模型。免疫组织化学法检测及对比RNA结合蛋白HuR在正常和糖尿病肾病患者肾活检组织,以及大鼠肾脏中的表达变化,特别是胞浆胞核的变化。同时观察上皮表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin及间质表型蛋白a-SMA, Vimentin的表达变化。(2)体外实验：体外培养永生化的肾小管上皮细胞HK-2分别在正常对照组,高糖培养组,及等渗对照组培养基中传代培养,并且与第24小时,48小时,72小时收获细胞进行指标检测。分别提取细胞胞浆,胞核以及全细胞中蛋白以用Westernblot方法检测检测高糖刺激前后细胞中HuR蛋白的变化及EMT相关表型蛋白表达含量,采用细胞免疫荧光检测高糖刺激前后HuR蛋白的移位变化。(3)免疫沉淀法检测RNA结合蛋白HuR与变化糖尿病肾病EMT相关蛋白c-fos,TGF-β1, Snail, CTGF蛋白的结合能力。根据人HuR mRNA基因编码区序列,利用计算机辅助设计软件设计4条针对HuR的siRNA (参照 http:// www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html),选择出一条干扰效率最强的的shRNA转染至HK-2细胞。(4)测定HuR干扰前后HuR与各因子mRNA结合水平,和对EMT相关蛋白及表型蛋白表达水平的影响。通过观察高糖环境下肾小管上皮细胞转分化时相关因子及RNA结合蛋白HuR的变化,探讨转录后调控在糖尿病肾病小管间质纤维化中的作用。研究结果(1)免疫组化结果显示,在正常人及正常大鼠肾组织部分肾小管细胞胞核中有HuR蛋白的表达,细胞浆中鲜有表达。在糖尿病肾病组织中,与正常组相比,人及大鼠DN组织中可见HuR在胞核及胞浆的表达均有明显增加。细胞免疫荧光及、Vesternblot结果显示,高糖刺激后HuR总蛋白较正常组及高糖组有所增加(p<0.05),胞核中蛋白表达无显著差异,胞浆中HuR在刺激48小时后有显著升高,但在72小时后水平有所恢复。(2) Westernblot结果显示,上皮细胞表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin表达下降,而间质表型蛋白a-SMA, Vimentin有所上升,而高糖诱导的c-fos,TGF-β1, Snail,CTGF蛋白表达水平均有不同程度的升高,免疫沉淀法显示四种蛋白与HuR蛋白结合能力各不相同。(3)行HuR干扰后,与高糖组相比,免疫沉淀法显示HuR与EMT各功能蛋白mRNA结合水平显著下降；Westernblot结果显示E-cadherin水平有所上升(P<0.05),而CK表达水平无明显变化,a-SMA与Vim蛋白表达水平下降(P<0.05)。EMT功能蛋白TGF-β1, Snail, CTGF均有不同程度的表达下降,c-fos由于其特性的不同其表达在高糖刺激前后及HuR干扰前后上升或下降的差异无统计学意义。研究结论由于RNA结合蛋白HuR的特殊生物学结构近特性,使其可能通过稳定EMT相关基因的mRNA,从而使其表达增多而在器官纤维化的发生发展中发挥着重要作用。HuR及EMT的相关表型蛋白在糖尿病肾病早期表达明显增高,干扰HuR后功能蛋白水平显著下调,提示HuR是否可以作为DN早期的诊断指标并且可能通过降低各种致纤维化因子的转录后水平来影响DN中小管上皮细胞EMT的发生。当然,HuR在糖尿病肾病中的具体调控网络尚待进一步研究,但HuR蛋白有望成为即肿瘤之后糖尿病肾病诊断及疾病进展的一种理想标志物,从而为器官纤维化的治疗提供新靶点,为糖尿病肾病患者治疗决策提供理论依据。第二部分 HuR在AngII刺激系膜细胞增殖中的影响研究背景肾小球系膜细胞(Human mesangial cells,HMCs)异常增殖作为一个显著特征可以存在于不同病理类型的慢性肾脏病中,这种异常增殖常常受到肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活的影响,在多种慢性肾脏病损伤以及疾病进展中起到重要作用,如在糖尿病肾病,IgA肾病,狼疮性肾炎中常常作为判断活动性病变的首要评分标准。血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)是RAAS中最主要的效应因子,其不仅可以影响肾小球血流动力学,更会刺激肾小球中的固有细胞引发异常增殖过程,并伴随过多细胞周期调节因子的产生。CyclinD1是最主要的调节G1/S期的周期蛋白,是反映细胞增殖状态的一个良好指标。HuR属ELAV家族中一员,可调节mRNAs稳定性及翻译,在不同细胞中起到转录后调节的作用。正常的细胞增殖需要CyclinD1的表达,但是CyclinD1得过度表达会引起细胞过度增殖作最终导致细胞内外基质的大量产生及最终肾小球纤维化等后果。观察人抗原R(human antigen R, HuR)在血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)激活下人系膜细胞(HMC)增殖中的作用,探讨转录后调控对慢性肾脏病细胞异常增殖的影响。因Cyclin D1 mRNA在3’UTR含有许多的AREs序列,可以被含有AREs-binding的结合蛋白如HuR蛋白结合,而RNA结合蛋白HuR在AngⅡ刺激下的系膜细胞增殖中的作用仍不清楚。因此,本研究将通过观察HuR蛋白表达变化,进一步阐述在慢性肾脏病中的作为初始环节的系膜细胞增殖过程中是否存在转录后调控的机制,从而使我们更好的认识慢性肾脏病的疾病进程,为延缓进入终末期肾脏病提供理论依据。研究方法(1)体内部分：选取正常人群以及不同水平系膜细胞增殖的慢性肾脏病如糖尿病肾病,狼疮性肾病,IgA肾病,紫癜性肾炎,原发性膜性肾病患者肾脏活检组织各5例,调阅病历,排除血浆AngⅡ水平在正常值范围内的患者,被确诊为以上疾病的患者血浆AngⅡ水平均高于正常值(请见表2)。血浆AngⅡ测量均在省立医院检验科采用放射免疫法统一测量。测得的患者24小时尿蛋白定量均在0.5g以上,血肌酐水平均在正常范围内(山东省立医院质量控制标准为40-135μmol/L)。免疫组织化学方法检测在各种系膜增殖性疾病中系膜细胞胞浆胞核人HuR蛋白的表达水平变化。(2)体外部分：a.配制浓度为100ng/ml的AngⅡ加入培养液中刺激人系膜细胞,分别观察0小时、3小时、12小时、18小时、24小时时所需指标的水平变化。细胞免疫化学方法检测HuR蛋白在各个时间点的表达变化；b. Westernb lot方法测定AngⅡ刺激HMC 0小时、3小时、12小时、18小时、24小时时胞浆HuR水平,以及HuR干扰前后CyclinDl mRNA及蛋白表达水平；c.流式细胞仪检测HuR干扰前后对AngⅡ诱导HMC细胞周期的影响；d.放线菌素D法检测AngⅡ刺激前后CyclinD1 mRNA稳定性的变化；e.CCK-8检测系膜细胞增殖水平；f.免疫沉淀法测定AngⅡ刺激前后HuR与CyclinDl mRNA结合水平。研究结果(1)免疫组织化学结果显示：正常人肾小球中有部分系膜细胞,细胞核中有少量HuR蛋白表达。而在糖尿病肾病,狼疮性肾炎全部组织中,与正常组相比,HuR蛋白在细胞浆中的含量显著增加。在系膜细胞轻度增殖的IgA肾病和紫癜性肾炎中,只有部分HuR蛋白在胞浆中表达增多。而在原发性膜性肾病患者系膜细胞中,HuR水平无显著变化。(2)细胞免疫组化学结果显示,与对照组相比,Ang刺激组可见HuR从胞核转移到胞质,其中在3小时和6小时变化胞浆中增加最为显著,之后水平逐渐恢复；相应的使用Westernblot方法观察HuR蛋白表达水平出现类似的变化趋势,可见第3小时和第6小时细胞胞浆中HuR蛋白的表达增加,细胞核中一过性减少,而总蛋白水平变化无统计学差异。(3)流式细胞仪分析经AngⅡ刺激后G1期细胞百分数均减少,S期百分数增加,表明系膜细胞进入增殖期。相应地,RT-PCR及Westemblot结果显示,AngⅡ诱导的CyclinD1 mRNA水平显著增加(P<0.05),蛋白水平明显增高(P<0.05)。免疫沉淀法显示AngⅡ刺激后的HuR 与 CyclinD1 mRNA结合能力显著升高(P<0.05)。经过AngⅡ刺激后的CyclinD1 mRNA稳定性明显延长,由正常的9.13小时升至20.34小时(P<0.05)。(4)在系膜细胞中对HuRmRNA进行沉默,qRT-PCR检测siHuR干扰后CyclinD1mRNA水平变化无统计学差异,但是Westernblot结果显示CyclinD1蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。流式细胞仪分析显示HuR干扰后G1期有所上升,S期和M期均有下降；免疫沉淀法显示HuR干扰后HuR与CyclinDl mRNA结合能力显著降低(P<0.05)。HuR干扰后,CyclinD1 mRNA稳定性有所下降,但未恢复正常水平,CCK-8检测到其增殖数量相比于AngⅡ刺激组显著减少。研究结论HuR与CyclinD1蛋白表达水平在病理性系膜细胞增殖发生时表达明显增高,特别是在血管紧张素AngⅡ刺激时增殖现象明显。具体表现为CyclinD1蛋白表达水平显著增高,并且伴随HuR蛋白从细胞核内转移至细胞浆内的一过性迁移性表现。在此过程中,我们推测是由于CyclinD1 mRNA的稳定性显著延长,导致其蛋白表达增多,从而造成系膜细胞的过度增生。而干扰HuR后CyclinD1 mRNA稳定性显著减少,蛋白水平下降,提示HuR可能通过降低CyclinD1转录后水平来影响肾脏细胞异常增殖的发生。如在此基础上进行相应的干预,进一步探讨抑制HuR对慢性肾脏病是否具有保护效应,一方面有助于帮助我们深入理解慢性肾脏病发生的病理生理机制,同时为寻求更可行、有效和安全的干预手段进行有意的尝试。