中国柑桔溃疡病菌遗传多样性分析及其防治药剂筛选

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柑桔溃疡病(citrus canker)是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodispv.citri)引起的柑桔毁灭性病害,为国内外重大检疫对象,主要侵染芸香科柑桔属、枳属及金柑属植物。该病害主要分布在亚洲、非洲及美洲的30多个国家,约占生产柑桔国家和地区的三分之一,其中以亚洲发生最为普遍。根据病原菌的地理分布和对寄主植物致病性不同,可将柑桔溃疡病菌分为5个菌系。Vauterin根据病菌致病性、寄主专化性和DNA杂交同源性的差异,将其分为柑桔、枳壳和枳柚3个致病型,分别为X.axonopodis pv.citri致病型Ⅰ,即A菌系;X.axonopodis pv.aurantifolia致病型Ⅱ,即B、C、D菌系和X.axonopodis pv.citrumelo致病型Ⅲ,即E菌系。近期在佛罗里达州发现一新菌系,被暂定为Aw菌系。柑桔溃疡病在我国广东、广西、福建、江西、浙江、湖南、云南、贵州等柑桔种植省(区)发生较普遍,在四川、湖北、重庆等省(市)有局部零星分布。国内研究者分别对四川、福建、广西3省的柑桔溃疡病菌进行了形态学、生理生化及致病性等方面研究,皆认为属于A菌系。本研究对采自我国9个省(区)柑桔溃疡病样品进行病菌分离及接种方法优选,同时对病菌DNA抽提方法进行筛选比较,然后对病菌DNA进行重复片段PCR基因指纹分析(Rep-PCR),以确定菌株的遗传多样性。针对较新的化学和生物药剂进行室内毒力和田间药效的筛选,为进一步深入研究我国柑桔溃疡病菌菌系及其有效防治奠定一定基础,取得的主要结果如下。1.比较了12种不同的病菌分离用消毒方式,发现70%酒精消毒9 s左右效果最佳,污染小,目标病原菌致病性无退化,经离体叶片接种后易分离得到目标菌株。2.首次应用微波法提取柑桔溃疡病DNA并加以优化,具有用时少、提取方便、DNA提取纯度较高等优点,用引物XCF/XCR PCR可很好的扩增出220 bp特异性条带。3.比较了微量抽提、高盐抽提、菌液裂解、SDS、微波抽提等5种柑桔溃疡病菌DNA提取方法,微量抽提法和高盐抽提法抽提DNA颜色较黄,易有杂质,SDS法及微波法抽提的为无色。用XCF/XCR引物PCR检测,微量抽提法和高盐抽提法皆是直接抽提病斑,微量抽提法效果较好;菌液裂解法、SDS、微波抽提皆是抽提分离纯化后的病菌菌株,三者比较,SDS抽提效果最好,微波法最适用于引物XCF/XCR检测,微量抽提法及SDS适用于引物JYF5/JYR5检测。4.比较了引物XCF/XCR和JYF5/JYR5的灵敏度,结果表明,引物XCF/XCR的灵敏度可以达到2.1×10-14μg/mL以上,优于引物JYF5/JYR5的灵敏度(21μg/mL)。5.对来自9个省(区)的病菌DNA进行Rep-PCR分析,结果表明引物(GTG)5、ITS、REP的扩增效果不理想,引物BOX和ERIC扩增的多态性谱带较多,而引物BOX优于引物ERIC。综合Box-PCR及Eric-PCR聚类分析,遗传距离为0.5时,云南、贵州、广西、广东、湖南、江西、福建的部分菌株与A菌系标准菌株的遗传距离较小,推测这些省份的菌株均为A菌系。云南、浙江、广东(寄主为纽荷尔)、湖北的菌株遗传距离比较大。云南省内部菌株之间遗传距离较大,这可能由于云南复杂的地理环境及品种调运引起。6.对24种药剂进行室内毒力测定,噻霉酮、农用硫酸链霉素及溴菌睛的效果较好,噻霉酮的毒力优于农用硫酸链霉素和溴菌睛。选择10种潜力较好药剂进行田间药效试验,结果表明春雷霉素400倍液、农用链霉素1000倍液、噻霉酮900倍液、琥胶肥酸铜600倍液对柑桔溃疡病防治效果较好,其中噻霉酮和琥胶肥酸铜为化学试剂,推荐在生产中使用生物制剂春雷霉素和农用链霉素。
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