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目的:锶是一种与钙同族且化学性质相似的碱土金属,它具有良好的亲骨活性,可以促进成骨细胞介导的骨形成,同时抑制破骨细胞介导的骨吸收,促进骨骼基质矿化,增加骨密度。锶类药物以及衍生生物材料在骨损伤与修复相关领域受到高度的关注。虽然目前已有多篇文献报道了锶的促成骨作用,但其相关分子机制报道相对较少,尚需进一步探讨其具体分子机制,为其在临床和生物材料中的应用提供支持证据。细胞自噬,又称巨自噬或宏自噬,是一种发生于真核细胞内的高度保守的自我降解现象,具有维持内环境稳态的作用。自噬在细胞的生长,分化,成熟与内稳态维持等多个方面均具有非常重要的作用。近期,有文章报道细胞自噬参与调控人体干细胞的成骨分化过程,但目前尚不清楚细胞自噬是否在锶诱导细胞成骨分化的过程中也发挥了相关的调控作用。本研究主要通过检测经锶处理的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1亚克隆14型的成骨分化情况与细胞自噬水平变化,探讨锶发挥促进成骨分化作用的相关分子机制。方法:1.锶的细胞毒性:应用不同浓度(0、3、6、12、24、48、96 mM)的锶离子溶液处理细胞并培养3天,通过MTT方法检测细胞增殖情况;2.锶促成骨分化作用:应用实时荧光定量PCR方法检测成骨指标RunX-2与OCN的表达情况;蛋白免疫印记电泳检测骨钙蛋白OCN的表达;并应用BCⅠP/NBT染色法观察细胞碱性磷酸酶染色;采用茜素红染色法观察细胞培养21天后基质矿化情况;综合上述结果,确定最适的锶处理浓度;3.自噬与锶促成骨分化:通过免疫蛋白印迹电泳检测自噬蛋白SQSTM1/p62与LC-3 Ⅰ/Ⅱ的表达,结合单丹黄酰尸胺荧光染色观察自噬小体生成情况。应用3-MA抑制细胞自噬后对细胞进行加锶处理,检测上述自噬与成骨分化指标,研究自噬在锶促进成骨分化中的作用;4.AMPK/TOR通路与锶促成骨分化:通过蛋白免疫印迹检测经锶处理后细胞中AMPK及其磷酸化水平、mTOR以及其磷酸化水平;用抑制剂Compound C阻止细胞AMPK磷酸化,通过蛋白免疫印迹检测细胞自噬蛋白LC-3 Ⅰ/Ⅱ型与骨钙蛋白OCN的表达情况,探讨AMPK/mTOR通路在锶经自噬促进成骨分化中的作用。结果:1.MTT结果显示,MC3T3-E1细胞经过较低浓度的锶(≤12 mM)处理后增殖情况与对照组相比无明显差异(p>0.05),而较高浓度(>12 mM)的锶可明显抑制细胞增殖(p<0.001),对细胞存在毒性作用;2.应用不同浓度锶处理细胞并对成骨相关指标进行观察,结果表明,细胞经3 mM浓度的锶处理后,成骨分化情况最佳,RunX-2与OCN的基因表达明显增高(p<0.01),碱性磷酸酶染色与茜素红着色增强,OCN蛋白表达明显增高(p<0.05),而当处理浓度在6 mM和12 mM时,细胞成骨分化的诱导效果均差于3 mM浓度,因此后续实验选用3 mM作为细胞刺激浓度;3.蛋白免疫印迹电泳结果显示,经锶处理诱导分化的细胞中SQSTM1/p62蛋白表达量明显降低(p<0.05),LC-3 Ⅱ型表达量明显升高(p<0.01),Ⅰ/Ⅱ型比值出现倒置,MDC染色可见自噬小体,细胞自噬处于活跃的状态;使用3-MA处理细胞后,细胞内SQSTM1/p62与LC-3 Ⅱ型蛋白表达量未见明显变化(p>0.05),Ⅰ/Ⅱ型比值未见倒置,MDC染色自噬小体少见,细胞自噬明显受到抑制,同时3-MA+Sr组细胞成骨蛋白OCN表达未见升高(p>0.05),碱性磷酸酶染色未见加深,细胞成骨效果不佳,锶的诱导成骨分化作用受到抑制;因此,自噬参与了锶的促成骨分化作用;4.蛋白免疫印迹结果显示,经锶作用后细胞内总AMPK表达量无明显变化,磷酸化AMPK表达量显著升高(p<0.05),下游调控分子总mTOR蛋白表达量未见明显变化,磷酸化mTOR表达量较对照组明显减弱(p<0.01),在经Compound C处理后细胞AMPK磷酸化受抑制的情况下,蛋白免疫印迹结果显示,自噬蛋白LC-3 Ⅱ型与骨钙蛋白OCN表达量相较对照组均减少,细胞自噬活性降低且此时锶无促进成骨细胞分化的作用。因此,AMPK/mTOR通路参与锶活化自噬的促成骨分化过程;结论:1.低浓度的锶(≤12 mM)对MC3T3-E1细胞的增殖无影响,无明显的细胞毒性,在此浓度范围内,3 mM是锶促进MC3T3-E1细胞成骨分化的最适浓度;2.细胞自噬参与锶促进细胞成骨分化的过程,相关信号通路分析表明,锶通过活化AMPK/mTOR信号通路调控细胞内自噬过程促进MC3T3-E1细胞的成骨分化活动。