论文部分内容阅读
中药有效成分是中药治疗与质量控制的物质基础。寻找适合于中药复杂体系中药效成分的研究方法,一直是中药研究的难点和关键问题之一。本文通过以动物口服中药黄芪、知母后的尿液为材料,采用HPLC-MS等高效灵敏的技术手段,建立有效的微量中药体内分析方法,分析鉴定中药黄芪、知母口服后进入尿液中的中药成分及其代谢产物,确定口服给药后尿液中的化学成分及其裂解途径。同时结合黄芪抗肾纤维化、知母降血糖药理指标检测,寻找尿中所含中药原型成分和代谢产物与中药药效之间的相关性,确定活性成分,初步阐明中药黄芪、知母在体内的药效物质。探索和初步建立从尿液成分的多样性分析中寻找有效物质的新模式,为中药药效物质的研究和发现提供新的方法学补充。本文取得以下主要研究结果：1.SD大鼠口服黄芪水提物含药尿液多成分分析和结构鉴定通过大鼠口服黄芪水提物,收集不同时间段的样,采用SPE等方法进行预处理,经HPLC-PDA-ESI-MS/MS分析测定,获得了尿样的总离子流图谱和各个离子的质谱分析图,建立了尿液中黄芪各成分及其代谢产物的液质联用分析方法。采用HPLC-PDA-ESI-MS/MS方法,首次从大鼠口服黄芪水提物后的尿样中分析鉴定出daidzein, genistein, quercetin, calycosin, L-asparamide-D-phenylalanine, Astragaloside-IV formononetin,4,2’,4’-trihydroxychalcone, calycosin-7-O-glucuronide, sulfation conjugate of daidzein, sulfonated conjugate of kaempferol和3,7-O-dimethylquercetin 12个成分,其中9种为黄芪原型成分,3种为代谢产物。初步明确了口服黄芪后吸收进入体内的小分子成分。这一研究结果迄今未见报道。2.SD大鼠口服知母水提液含药尿液多成分分析和结构鉴定建立了尿液中知母各成分及其代谢产物的HPLC-PDA-APCI-MS/MS分析方法。首次从大鼠口服知母水提物后的尿样中分析鉴定出neomangiferin, glucuronide and monomethyl conjugate of mangiferin, mangiferin, monomethyl conjugate of mangiferin, dimethyl conjugate of mangiferin, timosaponin N或timosaponin E1, timosaponin BII, timosaponin BⅢ或anemarsaponin C or xilingsaponin B anemarrhenasaponin I或anemarrhenasaponinⅡ, timosaponin All和timosaponin AⅢ11个成分,其中8种为知母原型成分,3种为代谢产物。初步明确了口服知母后吸收进入体内的小分子成分,为进一步阐明知母降血糖体内药效物质和作用机制提供了科学依据。这一研究结果迄今未见报道。3.黄芪抗肾纤维化体内外药理作用研究采用大鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型研究了黄芪水提物的抗肾纤维化作用。结果表明,中药黄芪水提物能改善大鼠UUO模型肾功能指标,降低血肌酐水平,抑制肾脏结缔组织生长因子(CTGF)表达。肾脏病理观察显示,黄芪水提物能减轻肾小管上皮细胞扁平化,肾小管扩张以及肾小管上皮细胞嗜碱性的病变程度。提示黄芪水提物具有一定的抗肾纤维化作用,其抑制CTGF表达可能是黄芪抗纤维化的作用机制之一。体外细胞实验研究表明,黄芪单体成分Astragaloside IV和Formononetin对TGF-β1诱导的HK-2细胞形态以及胶原Ⅰ、Ⅲ和纤连蛋白的分泌均无显著影响。提示黄芪抗肾纤维化作用可能通过其它成分或其它途径发挥,其体内药效物质和作用机制有待于进一步研究。4知母降血糖体内外药理作用研究在动物口服知母水提物后的含药尿液成分分析鉴定基础上,对知母吸收进入体内的主要小分子成分知母皂苷和知母黄酮进行了降血糖药效作用研究。对STZ糖尿病大鼠的药理研究表明,知母有效部位ZM-GT能显著降低STZ大鼠的随机血糖和空腹血糖,促进胰岛细胞的分泌,有效提高血清胰岛素水平。同时,显著降低血中尿素氮水平,对糖尿病大鼠的肾脏具有一定保护作用。提示ZM-GT具有抗糖尿病药效活性,是知母降血糖的有效部位。以α-糖苷酶为作用靶点建立体外糖苷酶抑制模型,结果表明ZM-GT、ZM-BII、ZM-MGG在体外对α-葡萄糖苷酶具不同程度的抑制活性。其中,ZM-MGG对抑制α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强,ZM次之,ZM-BII的抑制活性较弱。ICR小鼠糖耐量实验结果表明：ZM-GT、ZM-BII能显著降低ICR小鼠的餐后血糖,有效改善ICR小鼠的糖负荷。以上研究提示ZM-GT是知母降血糖的有效部位,其中ZM-BII和ZM-MGG可能是其中的主要降糖成分。