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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种传染性、致死性疾病,对我国乃至全世界范围养猪业造成巨大的经济损失。目前,CSF在我国呈散发或地方性流行,疫苗免疫仍然是预防、控制和消灭CSF的主要手段。猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)因其安全有效而获得广泛应用,在CSF防控中发挥了巨大作用。但是,C株不具有标记特性,无法区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于CSF的根除与净化。另外,C株、亚单位疫苗等常规疫苗均采用肌肉注射的免疫途径,易产生应激反应,且无法满足野猪的免疫需求。而口服疫苗免疫简单、方便,不仅能够诱导全身性免疫反应,也能够诱导局部黏膜免疫,可在病原入侵位点建立屏障,直接切断病原的入侵。乳酸菌是一种理想的口服疫苗递呈载体,能够抵抗胃肠道酸性环境和胆盐等的侵蚀,将抗原完整地递呈至肠道免疫诱导位点,同时在维持机体肠道菌群动态平衡、促进动物营养物质的吸收等方面发挥着巨大作用。本研究首先利用食品级诱导表达NICE系统,以其配套的载体pNZ8149分别融合表达CSFV E2蛋白与沙门氏菌侵袭蛋白RCK或耶尔森氏菌外膜蛋白OmpH,成功构建了两株重组乳酸乳球菌rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH。Western blotting检测结果显示rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH分别成功表达了42 kDa和39 kDa的融合蛋白,大小与预期一致;通过家兔免疫攻毒试验评价两株重组乳酸乳球菌的免疫效力,结果显示,将rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH口服免疫家兔后,检测一免、二免及三免后的不同时间点免疫组家兔血清中抗CSFV特异性ELISA抗体均为阴性,中和抗体滴度﹤10;三免后7 d使用C株进行攻毒,rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH免疫家兔全部产生定型热反应,两株重组乳酸乳球菌未能提供免疫保护。之后,本研究选择定植能力更强、定植时间更长的植物乳杆菌作为载体,将植物乳杆菌NC8作为宿主菌株,构建了表达CSFV E2蛋白的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2,体外检测证实NC8-pSIP409-E2成功表达了42 kDa E2蛋白,蛋白大小与预期一致;将重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2口服免疫小鼠进行免疫效力评价,免疫后不同时间点检测血清中的特异性IgG抗体水平和粪便中特异性sIgA抗体水平,结果显示与阴性对照组相比,重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2免疫组小鼠血清中IgG抗体水平无明显变化,而粪便中sIgA抗体水平略微升高;进一步分离小鼠外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞分别进行T淋巴细胞亚型分析和淋巴细胞增殖试验,与对照组相比,免疫组小鼠CD4~+和CD8~+T细胞比例和淋巴细胞刺激指数显著升高,表明重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2免疫后能够增强细胞免疫应答。最后,为了开发更合适的乳酸菌载体,优化E2抗原蛋白的表达和递呈,本研究中分离得到3株野猪源乳酸菌,并对其进行了载体开发的初步研究和安全性评价,有望将其改造为口服疫苗载体诱导高水平的免疫应答。本研究利用乳酸乳球菌和植物乳杆菌两种载体,成功构建了表达CSFV E2蛋白的重组乳酸乳球菌和重组植物乳杆菌。动物试验结果表明:重组乳酸乳球菌免疫家兔后未诱导机体产生免疫应答,未能提供免疫保护;重组植物乳杆菌免疫小鼠后诱导机体产生了细胞免疫应答。另外,分离得到的3株野猪源乳酸菌,有作为口服疫苗载体的潜力,可进一步应用于CSF口服疫苗的研制。