肺动脉高压(PAH)是一种严重且致命的疾病。其特点是肺动脉压升高和肺的病理改变,如内皮损伤,肺血管平滑肌细胞增殖和迁移所导致的肺血管腔减小,以及最终伴发的右心室肥厚和终末期心脏衰竭。但是肺动脉高压至今缺乏高效特异性的治疗方法,尽管常规疗法有显著进步,预后却仍然不理想。近年来干细胞被成功应用于多种疾病的治疗。由于它所具有的,相比一般药物治疗更高的安全有效性,干细胞治疗已成为疾病治疗策略的研究热点,并被运用于对肺动脉高压的治疗研究中。最近在脂肪分化、关节损伤等疾病模型中发现干细胞治疗的疗效存在性别差异。而对于干细胞治疗肺动脉高压效果的性别差异和其潜在的机制却未有研究。本研究在探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗肺动脉高压性别差异的实验中,发现雌性BMSCs无论以性别匹配或不匹配方式治疗野百合碱(MCT)诱导的小鼠肺动脉高压均比雄性BMSCs有更好的治疗效果,表现为右心室肥厚和肺阻力血管肌化程度有更大幅度的降低。体外实验中在炎症、氧化应激状态下,BMSCs的[Ca2+]i动力学、增殖和迁移能力均有显著的性别差异。出乎意料的是,我们发现雌性BMSCs的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白水平比雄性BMSCs高得多。GAPDH最近已被证明是一种多功能蛋白质,具有不同的功能。我们通过分子生物学技术敲除雌性BMSCs的GAPDH或在雄性BMSCs过表达GAPDH,均能逆转上述细胞生物学行为和治疗效果的差异。综上,我们的实验结果表明GAPDH在雌性BMSCs通过调节细胞内[Ca2+]i信号及相关的细胞行为,从而在治疗肺动脉高压过程中发挥比雄性BMSCs更加优越的治疗作用。第一部分骨髓间充质干细胞性别对小鼠肺动脉高压疗效的影响目的：干细胞引入体内后,为特异性示踪其定位与变化,现多采用将雄性干细胞引入雌性动物体内,藉由Y染色体来特异示踪,因此不可避免地忽视了干细胞性别差异对治疗效果的影响。本实验利用分离自同胎生雌性和雄性小鼠的不同性别骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察干细胞性别差异对肺动脉高压治疗效果的影响。方法：本实验采用8周龄体重在22g左右的C57小鼠,尾静脉注射60mg/kg的野百合碱MCT诱导肺动脉高压模型,在MCT注射三天后分组静脉给予2×106个不同性别BMSCs治疗,28天后以右心肥厚指数RV/(LV+S)(右心室／(左心室+间隔))和肺组织病理切片所显示的肺血管肌化程度(1muscularization)为指标,评估治疗效果。结果：(1)光学显微镜下可见单个BMSC呈梭形多角形,细胞融合后呈铺路石样；流式鉴定细胞表面标志：CD29-PE+(99.96%±0.03%); CD34-PE-(0.34%±0.13%); CD45-APC-Cy7(1.97%±0.38%)。(2)在对MCT诱导的肺动脉高压治疗中,雌性小鼠右心肥厚指数造模后明显增加(0.278±0.009vs0.357±0.019,p<0.05),雌性BMSCs降低右心肥厚指数的作用表现出明显优于雄性BMSCs的作用(0.275±0.026vs0.311±0.022,p<0.05)；且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同样表现出明显优于雄性BMSCs的作用(0.2835±0.028vVs0.326±0.045,p<0.05)。(3)在对MCT诱导的肺动脉高压治疗中,雌性小鼠肺动脉肌化(muscularization)造模后明显增加(38.3%±2.9%vs82.3%±7.8%,p<0.05),但是雌性BMSCs降低肺动脉肌化的作用明显优于雄性BMSCs的作用(41.7%±5.8%vs55.3%±5.0%,p<0.05)；且在雄性小鼠,雌性BMSCs也同样表现出明显优于雄性BMSCs的作用(40.0%±4.8%vs54.0%±6.9%,p<0.05)。结论：在MCT诱导的小鼠肺动脉高压模型中,雌、雄BMSCs均可以有效减缓模型小鼠右心室肥厚和肺动脉肌化程度,从而起到有效治疗肺动脉高压的作用,而雌性BMSCs则表现出更优于雄性BMSCs的治疗效果。第二部分离体实验研究骨髓间充质干细胞性别差异的生物机制目的：骨髓间充质干细胞(BMSCs)在被引入发生肺动脉高压的人和动物体内后必然置身于不同的病理内环境,比较常见的包括氧化应激、炎症反应等等。BMSCs要发挥其修复内皮和治疗肺动脉高压的作用,必须能够适应这些微环境。观察并比较在氧化应激、炎症反应时雌、雄BMSCs生物学行为包括钙信号、增殖和迁移能力、connexin43表达等方面的差异,以期阐明BMSCs在肺动脉高压治疗中表现出来的性别差异的机制。方法：用不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)的组胺和不同浓度(100μmol/L.250μmol/L、500μmol/L)过氧化氢(H2O2)刺激BMSCs,同时用实时荧光离子成像系统检测[Ca2+]i变化,确定能够使BMSCs表现出明显不同的钙信号差异的组胺和H2O2的浓度。用确定浓度后的组胺和H2O2刺激BMSCs,用MTS检测BMSCs增殖,用transwell小室检测迁移能力的差异,用westernblot方法观察和比较雌、雄BMSCs中connexin43和GAPDH的蛋白水平。结果：(1)组胺诱导雌、雄BMSCs的钙反应：1μM组胺刺激雌性BMSCs (F-BMSCs)约78%细胞呈现典型的钙振荡,雄性BMSCs (M-BMSCs)71.4%细胞呈现典型的钙峰之后持续的钙升高；10μM组胺刺激F-BMSCs约78%细胞呈现典型的钙振荡,74%M-BMSCs呈现典型的钙峰之后持续的钙升高；100μM组胺刺激F-BMSCs约61%细胞呈现典型的钙峰之后持续的钙升高,67.4%M-BMSCs呈现典型的钙峰之后持续的钙升高。(2)H2O2诱导雌、雄BMSCs的钙反应：100μM H2O2刺激雌性BMSCs (F-BMSCs)约81%细胞呈现典型的钙振荡,雄性BMSCs (M-BMSCs)79.5%细胞呈现典型的钙峰之后持续的钙升高；250μM H2O2刺激F-BMSCs约73.3%细胞呈现典型的钙振荡,75%M-BMSCs呈现典型的钙峰之后持续的钙升高；500μM H2O2刺激F-BMSCs约73%细胞呈现典型的钙振荡,79%M-BMSCs呈现典型的钙峰之后持续的钙升高。(3)从雌、雄BMSCs增殖曲线可以看出,雌性BMSCs相比于雄性BMSCs增殖更快；在细胞生长滞后阶段用10μM组胺和100μM H2O2刺激后细胞的增殖,雌、雄BMSCs在没有刺激时增殖没有明显差异,但10μM组胺刺激后雌性BMSCs增殖加快,而雄性BMSCs增殖无明显改变(1.42±0.08vs1.01±0.05,p<0.05),100μM H2O2刺激后雌性BMSCs增殖也加快,而雄性BMSCs增殖无明显改变(1.34±0.11vs0.94±0.06,p<0.05)。(4)用10μM组胺和100μM H2O2刺激后细胞的迁移,雌性BMSCs没有刺激时迁移每个视野细胞个数比雄性BMSCs多(32.6±5.8vs29.8±4.9,p<0.05),10μM组胺刺激后雌性BMSCs迁移细胞增加而雄性BMSCs无明显改变(40.8±7.7vs30.4±4.0,p<0.05)；100μM H2O2刺激后雌性BMSCs迁移细胞增加而雄性BMSCs无明显改变(42.3±8.4vs32.4±5.4,p<0.05)。(5)组胺和H202刺激后BMSCs的Connexin43表达：雌、雄BMSCs在没有刺激时Connexin43的磷酸化和非磷酸化表达没有明显差异,组胺刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs减少(1.83+0.44vs0.57+0.14,p<0.05),雌性BMSCs非磷酸化Cx43(dpCx43)减少而雄性BMSCs增加(0.66+0.33vs1.464±0.19,p<0.05)；H202刺激后雌性BMSCs磷酸化Connexin43(pCx43)增加而雄性BMSCs减少(1.65±0.27vs0.60±0.03,p<0.05),雌性BMSCs非磷酸化Cx43(dpCx43)而雄性BMSCs增加(0.89±0.19vs1.314±0.14,p<0.05)。(6)组胺和H202刺激后BMSCs的GAPDH表达：在无任何刺激时,雄性BMSCs的GAPDH基础水平只有于雌性BMSCs的0.626±0.07倍(p<0.05)；雌性BMSCs在组胺刺激后GAPDH表达增加1.38±0.15倍(p<0.05),在H2O2刺激后增加1.36±0.17倍(p<0.05)；而雄性BMSCs则在上述刺激后均没有发生明显的GAPDH表达水平变化(vs M-BMSCs blankcontrol, p>0.05)。结论：在用H2O2和/或组胺模拟体内氧化应激、炎症状态等刺激的体外试验中,不同性别BMSCs在细胞增殖、迁移和[Ca2+]i的动力学等方面均具有显著性差异。出乎意料的是,与雄性BMSCs相比,雌性BMSCs具有更高的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)蛋白表达水平。GAPDH最近已被证明是一种多功能蛋白质,具有不同的功能。我们提出GAPDH可能是BMSCs存在性别差异的关键因素。第三部分在体实验研究骨髓间充质干细胞性别差异影响疗效的机制目的：为了探讨GAPDH在骨髓间充质干细胞(BMSCs)对小鼠肺动脉高压治疗中的关键作用,以及在体跟踪BMSCs治疗肺动脉高压可能的机制。方法：分离纯化同胎生不同性别C57小鼠的BMSCs,利用GAPDH的过表达(overexpression-GAPDH)或干扰质粒(siRNA-GAPDH)人为调控雌、雄BMSCs中GAPDH的表达,通过对细胞在[Ca2+]i动力学、增殖和迁移能力等方面的检测,评估GAPDH的表达对BMSCs生物学行为的影响。在体实验利用MCT诱导的肺动脉高压小鼠模型,雌雄模型小鼠分组给予人为干预GAPDH表达的雌、雄BMSCs治疗,并利用质粒本身所携带的GFP对干细胞进行示踪,利用组织免疫荧光技术观测BMSCs对血管内皮的修复。结果：(1) westernblot检测转染后BMSCs的GAPDH蛋白水平：干扰后雌性BMSCs的GAPDH的水平与雄性BMSCs的基础水平没有明显差别,而过表达后的雄性BMSCs的GAPDH的水平明显升高且与雌性BMSCs的基础水平没有明显差别。(2)组胺和H202诱导转染后BMSCs的钙反应：10μM组胺刺激雌性BMSCs空质粒组(F-BMSCs+siRNA vector)约65%的胞呈现典型的钙振荡,雌性BMSCs干扰组(F-BMSCs+siRNA-GAPDH)约57%的细胞呈现典型的钙峰之后持续的钙升高,雄性BMSCs空质粒组(M-BMSCs+overexpression vector)约68%的细胞呈现典型的钙峰之后持续的钙升高,雄性BMSCs过表达组(M-BMSCs+overexpression-GAPDH)约64%的细胞呈现典型的钙振荡；100μM H2O2刺激F-BMSCs+siRNA vector约64%的细胞呈现典型的钙振荡,约71%的F-BMSCs+siRNA-GAPDH呈现典型的钙峰之后持续的钙升高,约79%的M-BMSCs+overexpression vector呈现典型的钙峰之后持续的钙升高,约60%的M-BMSCs+overexpression-GAPDH呈现典型的钙振荡。(3)组胺和H202诱导转染后BMSCs的增殖和迁移：组胺和H202诱导干扰GAPDH的雌性BMSCs后增殖没有明显改变,而过表达GAPDH的雄性BMSCs则增殖加快(*p<0.05),有效地逆转了雌、雄BMSCs增殖的差异；组胺和H2O2诱导干扰GAPDH的雌性BMSCs后迁移没有明显改变,而过表达GAPDH的雄性BMSCs则迁移加快(*p0.05),有效地逆转了雌、雄BMSCs迁移能力的差异。(4)转染后BMSCs治疗小鼠肺动脉高压的疗效：过表达GAPDH的雄性BMSCs对于缓解MCT诱导的鼠肺动脉高压模型右心室肥厚RV/(LV+S)优于干扰GAPDH的雌性BMSCs (*p<0.05);过表达GAPDH的雄性BMSCs对于缓解MCT诱导的鼠肺动脉高压模型的肺血管肌化程度优于干扰GAPDH的雌性BMSCs (*p<0.05)。(5)在体观察转染后BMSCs治疗小鼠肺动脉高压的疗效：无论是雌性老鼠还是雄性老鼠,过表达GAPDH的雄性BMSCs参与血管内皮的修复占血管总数的比例明显升高(*p<0.05),干扰GAPDH的雌性BMSCs参与血管内皮的修复占血管总数的比例降低(*p<0.05)。结论：GAPDH最近已被证明是一种多功能蛋白质,具有不同的功能。我们通过分子生物学技术人为调控GAPDH在雌性和／或雄性BMSCs中的表达,有效逆转了雌、雄BMSCs在生物学行为和对肺动脉高压治疗效果上的差异。在体示踪技术显示我们植入的BMSCs可以直接参与血管内皮的修复。