第一部分 全氟辛酸与脂质代谢紊乱的相关性研究背景:全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)是当今世界上最受关注的一种环境污染物,其具有优良的分子结构稳定性和热稳定性,并具有独特的疏水、疏油的特性。在碳氧化合物极低的情况下能在其表面使氟化物具有较高的表面活性,是合成聚四氟乙烯化工产品的重要原料。因此,PFOA被普遍应用于工业生产和日常消费品中。近年来,随着全氟类有机酸(PFs)的相关研究逐渐增多,PFOA的难降解性、生态循环持久性及生物蓄积性日益被人们所重视,同时研究表明,在不同地域、环境下,人体内和野生动物体内都检测到不同浓度的PFOA。此外,PFOA主要毒性效应表现为肝脏毒性、脂质代谢、类固醇激素水平紊乱以及生殖功能障碍等。体内实验表明,PFOA对脂质代谢功能具有一定的影响。目前仅限于动物实验的研究。国外研究报道,PFOA含量与脂质代谢紊乱可能具有关联,目前也仅限于临床表型性观察与初步性分析。然而,由于各个研究方法局限性(单因素分析,人群不一致等),目前得出的结论尚未能一致。因此,需要开展相关的文献分析并讨论两者之间的关联性。目的:通过文献分析探索PFOA与脂质代谢紊乱的相关性。方法:本部分通过检索PubMed、中国生物医学文献数据库、中国期刊全文数据库、万方数据库、中国知网数据库、维普数据库,搜索有关PFOA与脂质代谢紊乱相关性研究文献,用Excel表格汇总相关数据,并用PPT以及Photoshop作图进行数据分析和结果讨论。结果:动物实验研究表明PFOA影响脂质代谢功能,而PFOA与人体脂质代谢紊乱的相关性并还未能得出一致性的结论,但从大部分的横断面研究数据中可以表明PFOA可能与脂质代谢紊乱具有一定相关性,并初步结论是PFOA与总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)存在正相关,而与甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)的相关性不明显且不一致。结论:动物实验结果揭示了 PFOA干扰脂质代谢功能。虽然由于横截面性质,目前的文献报道没有明确PFOA暴露与人体脂质代谢紊乱之间的关联性,PFOA与人体脂质代谢紊乱的相关性尚未得出明确一致的结论,但是目前结果仍为今后的流行病学和内分泌毒理学研究提供了一定的理论依据。第二部分环境污染物PFOA暴露对肝细胞脂质代谢的影响背景:越来越多的证据表明,广泛使用的全氟辛酸(PFOA)是一种与脂质代谢障碍有关的环境污染物。然而,其内分泌干效应的生物学机制仍未得到揭示。在本部分研究中,本课题组建立了 PFOA导致小鼠肝脏损伤的模型,通过生化分析,细胞生物学等手段来探讨PFOA诱导小鼠肝脏脂质紊乱的毒理机制。目的:研究PFOA暴露小鼠的肝脏脂代谢相关基因的表达情况以探讨PFOA对肝细胞脂质代谢紊乱的分子机制。材料与方法:成年雄性Balb/c小鼠随机分组:暴露于PFOA组1mg/kg/d、暴露于PFOA组5mg/kg/d,正常对照组小鼠口服等量蒸馏水。实验结束后,摘取眼球收集小鼠血液,分离肝组织待用。通过ELISA法测定PFOA暴露小鼠血液中游离脂肪酸(FFA)和TG的浓度。HE染色观察肝细胞结构变化,并通过定量RT-PCR检测肝脏细胞内脂肪酸转运酶(CD36mRNA),脂蛋白脂肪酶(LPL mRNA),及载脂蛋白B(APOB mRNA)的表达情况。此外,应用Western blot测定相关蛋白水平的表达情况。结果:与对照组小鼠比较,PFOA暴露小鼠血清转氨酶(ALT)升高,甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)含量降低,肝脏细胞TG水平升高。形态学上,PFOA暴露小鼠的肝脏细胞质中有明显的空泡形成,并有一定的炎症浸润。RT-PCR结果显示,PFOA暴露小鼠肝组织中LPL,CD36 mRNAs表达上调,而ApoB表达下调。此外,免疫组织化学和免疫印迹数据表明PFOA暴露的肝组织中内源性LPL和CD36阳性细胞数和蛋白表达量以剂量依赖性地增加,而APOB蛋白含量降低。结论:目前的研究结果表明,PFOA诱导的脂质代谢障碍可能与肝脏细胞内脂质类转运失调有关。第三部分基于信息生物学研究全氟辛酸对肝细胞的PPARα/ERα/HNF4α信号通路的影响背景:研究表明,PFOA影响啮齿动物的肝脏细胞功能。在分子水平上,其肝毒副作用可能与PFOA介导的过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的激活有关。然而,其介导的具体内分泌毒性信号通路尚未揭示。本部分研究基于生物信息学分析并筛选低浓度PFOA干扰肝细胞脂质代谢的关键通路:(1)诱导雌激素受体(ERα)信号通路;(2)激活过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)表达;(3)促进肝脏和胚胎发育必需因子肝细胞核因子4α(HNF4α)信号通路。目的:采用小鼠源性肝脏细胞模型验证不同浓度PFOA暴露对细胞内源性PPARα/ERα/HNF4α信号通路及脂质产物表达的影响。方法:体外培养鼠源正常肝细胞AML12,暴露在不同浓度的PFOA后进行相关实验,以MTT法检测细胞的增殖活性,生化试剂盒检测肝细胞TC、TG含量及乳酸脱氢酶(LDH)水平,免疫荧光染色测定PFOA干预AML12细胞内源性PPARα、ERα HNF4α、CD36及ApoB阳性表达情况,并经免疫印迹(WB)检测PFOA暴露后的肝细胞内源性PPARα、ERα、HNF4α蛋白及ApoB蛋白表达。结果:MTT结果显示,低浓度PFOA诱导AML12细胞生长,而高浓度PFOA则抑制细胞增殖。生化检测结果显示,低浓度PFOA暴露后的肝细胞增殖活跃,乳酸脱氢酶(LDH)水平,TC,TG含量增加。免疫荧光染色分析表明,低浓度PFOA暴露细胞内源性PPARα,ERα,HNF4α,CD36阳性表达上调,而ApoB 阳性细胞计数减少。免疫印迹验证结果显示,低浓度PFOA暴露后的肝细胞内源性PPARα,ERα,HNF4α蛋白上调,而ApoB蛋白表达下调。结论:目前的实验结果揭示低浓度PFOA通过激活肝细胞内源性PPARα/ERα/HNF4α信号通路而诱导肝细胞脂肪变性的分子作用机制。