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大脑是人类最复杂和最重要的器官之一,缺氧和缺血会对大脑造成严重的不可逆的损伤,甚至会导致脑死亡。目前针对脑缺血和缺氧的治疗策略非常有限,所有治疗方案均不能有效的改善神经功能,因此迫切地需要开发抗脑缺血和缺氧的新治疗方法。神经干细胞即存在中枢神经系统中具有分裂潜能和自我更新能力的一类母细胞。通过分泌外泌体与其他组织细胞相互交流信息,发挥干细胞的治疗作用。已经在几种不同类型的疾病中显示出令人鼓舞的治疗效果,包括肾损伤、心脏损伤、脑损伤和肝肺损伤等。然而,对神经干细胞及其来源外泌体的研究较少,其生物学功能及作用机制尚不清楚,对其深入研究将有助于为缺氧缺血性脑部疾病的治疗提供新的思路和理论依据。方法:取新生大鼠大脑皮质,分离神经干细胞进行体外培养,采用免疫荧光检测原代大鼠神经干细胞中干细胞标记Nestin的表达情况。收集神经干细胞培养上清,使用超速离心法进行外泌体提取。使用透射电镜扫描提取的外泌体形态,Western blot检测CD63和CD81表达水平,使用纳米颗粒跟踪分析仪对神经干细胞外泌体进行粒径分析。使用流式细胞术检测神经干细胞外泌体处理对常氧和氧葡萄糖剥夺条件下培养的SH-SY5Y细胞的凋亡情况。使用MTT法检测神经干细胞外泌体处理对常氧和氧葡萄糖剥夺条件下培养的SH-SY5Y细胞增殖的影响。采用HE染色观察脑组织结构,Nissl染色检测对尼氏体的影响,使用TUNEL染色检测对神经细胞凋亡的影响,使用免疫荧光技术检测脑组织中MBP,NeuN和NG2阳性的细胞数量的影响。收集神经干细胞和神经干细胞外泌体进行microRNA芯片测序检测,探究两者之间miRNA谱的变化。miR-150-3p mimics和miR-150-3p inhibitor在体外处理SH-SY5Y细胞,使用流式细胞术和CCK-8分别检测其凋亡和增殖能力。HE染色观察miR-150-3p mimics和miR-150-3p inhibitor处眼的MCAO鼠脑组织结构。使用Nissl染色观察对尼氏体的影响。TUNEL染色检测对神经细胞凋亡的影响。使用免疫荧光技术检测对MCAO模型鼠脑组织中MBP,NeuN和NG2阳性的细胞数量的影响。使用miRNA靶基因预测网站miRDB和TargetScan预测miR-150-3p潜在的靶基因。双荧光素酶报告基因检测miR-150-3p和预测的靶基因caspase 2靶向调节。使用qPCR检测调控miR-150-3p的表达对其靶基因caspase 2的影响。免疫荧光检测miR-150-3p mimics和miR-150-3p inhibitor处理对MCAO鼠脑组织caspase 2的蛋白表达的影响。使用Western blot检测miR-150-3p mimic和miR-150-3p inhibitor对SH-SY5Y细胞Bax,cleaved-caspase3,Caspase2和Bcl-2的表达量的影响。Western blot检测在常气和氧葡萄糖剥夺条件下,神经干细胞外泌体处理对SH-SY5Y细胞中Bax,cleaved-caspase3,Caspase2 和 Bcl-2表达量的影响。免疫荧光检测神经干细胞外泌体对caspase2的蛋白表达的影响。结果:成功建立体外原代神经干细胞培养体系,培养14天后悬浮的神经干细胞出现融合。神经干细胞的Nestin蛋白阳性率超过90%。分离得到的外泌体呈现出典型的圆形双层碟状囊泡,分离的外泌体高表达特异性标记物CD63和CD81,不表达内质网特异性标记物calnexin,收集的外泌体的平均大小为146.5nm,浓度为1.79E+11。神经干细胞外泌体处理在常氧和氧葡萄糖剥夺培养条件下均能抑制SH-SY5Y细胞凋亡,促进SH-SY5Y细胞的增殖。神经干细胞外泌体和神经干细胞之间共鉴定出198个不同表达的miRNAs,其中146个miRNAs上调,52个miRNAs下调。表达量上升最明显的5个miRNAs是miR-150-3p、miR-1248、miR-5089-5p、miR-3916和miR-6803-3p;表达量下调最明显的5个miRNAs是miR-551b-5p、miR-548az-5p、miR-548、miR-3175和miR-6763-5p。miR-150-3p是上调最显著的miRNAs。在常氧和氧葡萄糖剥夺培养条件下,miR-150-3p mimics抑制SH-SY5Y细胞的凋亡,而miR-150-3p inhibitor明显促进SH-SY5Y细胞的调亡。miR-150-3p mimics明显提高了SH-SY5Y细胞的增殖能力,miR-150-3p inhibitor则显著抑制SH-SY5Y细胞的增殖。Nissl染色显示miR-150-3p mimics组中神经元有序排列,可见尼氏染色,尼氏体数量明显增加,而miR-150-3p inhibitor则加剧了神经元损伤,尼氏体丢失增多。TUNEL染色显示,miR-150-3p mimics处理组凋亡的神经细胞明显减少,而miR-150-3p inhibitor凋亡的细胞明显增多。免疫荧光染色显示miR-150-3p mimics增加MBP阳性的少突胶质细胞,NeuN阳性的神经细胞和NG2阳性细胞数量,而miR-150-3p inhibitor处理减少MBP阳性的少突胶质细胞,NeuN阳性的神经细胞和NG2阳性细胞数量。预测分析显示Caspase-2是miR-150-3p潜在的靶基因。双荧光素酶报告基因证实miR-150-3p和caspase 2之间存在靶向结合位点。在常氧和氧葡萄糖剥夺条件下,miR-150-3p mimic均能显著降低caspase 2的mRNA水平,而miR-150-3p inhibitor均显著诱导了caspase 2的mRNA表达水平。免疫荧光检测表明miR-150-3p mimic抑制caspase 2的蛋白水平,miR-150-3p inhibitor促进caspase 2的蛋白表达水平。miR-150-3p mimic均能显著降低Bax,cleaved-caspase 3和Caspase2的表达,诱导Bcl-2的表达,而miR-150-3p inhibitor均显著诱导Bax,cleaved-caspase3和Caspase2的表达,抑制Bcl-2的表达。此外,免疫荧光检测显示神经干细胞外泌体处理抑制MCAO模型脑组织中caspase 2的蛋白表达。结论:神经干细胞外泌体在体内、体外都能够促进神经细胞增殖,并抑制其凋亡,显示出神经保护作用。神经干细胞外泌体和神经干细胞之间的miRNAs表达谱发生改变,miR-150-3p是上调最明显的miRNAs。miR-150-3p促进神经细胞增殖并抑制其凋亡,并能够逆转MCAO模型中尼氏体丢失的现象,增加MBP阳性、NeuN阳性和NG2阳性细胞的数量,而干扰miR-150-3p表达则抑制神经细胞增殖并促进其凋亡,加剧MCAO模型中尼氏体丢失的现象,降低MBP阳性、NeuN阳性和NG2阳性细胞的数量。miR-150-3p是caspase 2基因的上游调节性miRNA,通过直接靶向抑制caspase 2的表达,抑制凋亡相关基因Bax,cleaved-caspase3和Caspase2的表达,诱导抗凋亡基因Bcl-2的表达,促进神经细胞增殖。