研究背景和目的：原发性肝癌是发生在肝细胞或肝内胆管细胞的一种恶性程度高、进展快、预后差的恶性肿瘤,其发病率在恶性肿瘤中排名第六，死亡率居第三。全世界半数左右的肝癌病人集中在中国，严重危害我国人民的健康。近年来，通过高通量蛋白芯片和蛋白质组学等技术，在新的肝癌转移复发标志物的研究方面已经有较大的进展。建立肝癌转移的多分子预测模型，经大量临床标本进一步验证，尤其是前瞻性规模化验证和加速临床应用将是今后的主要趋势和研究重点，对改善预后具有非常重要的临床意义。真核细胞内的蛋白质主要有两种降解途径：泛素-蛋白酶体途径和溶酶体途径。其中，泛素-蛋白酶体途径能够高选择性地降解那些细胞在应激和非应激条件下产生的蛋白质，对维持细胞正常生理功能具有十分重要的意义。近年研究发现，泛素化与去泛素化的改变和多种肿瘤的发生密切相关，恶性肿瘤多伴随癌基因和抑癌基因产物的表达异常。基于上述研究背景，我们推测蛋白降解系统中的关键分子，可能通过直接影响与某些癌基因表达相关的蛋白质水平，在肝癌发生发展过程中起重要作用，从而具有作为肝癌预后及治疗靶标的价值。我们与美国的合作实验室利用基因表达谱芯片检测了70例肝癌患者癌和癌旁组织，通过统计分析,我们筛选出了一组与蛋白降解相关的在肝癌中异常表达的基因：PSMD4、UBD和CSTB，并计划深入研究它们的生物学功能。PSMD4基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基4（26S proteasomenon-ATPase regulatory subunit4)，该分子含有两段15个氨基酸的泛素相互作用模序（ubiquitin interacting motif，UIM），能够选择性结合泛素化蛋白，介导蛋白质降解。已有研究报道，PSMD4异常表达与炎症性肠病、溃疡性结肠炎等疾病相关，PSMD4在肝癌中的表达及生物学功能尚不十分清楚，与肝癌患者的预后关系也未见报道。国外科研机构和本实验室的前期研究已经发现，与PSMD4同属人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基的PSMD10，又称癌基因p28GANK，其编码的蛋白Gankyrin与肝癌发生发展关系密切，PSMD4是否也像Gankyrin一样在肝癌发生发展中发挥重要作用，两者之间是否有类似之处，值得我们深入研究。泛素样蛋白D（Ubiquitin D,UBD）属于泛素样蛋白家族，能够共价结合靶蛋白，使其经蛋白酶体降解。UBD能够通过降解IκBα，调节TNF-α或者LPS诱导的内在免疫激活，并且可能参与了DC细胞的成熟过程，故以往研究局限于其在免疫系统中的作用。UBD在肝癌中的表达情况及其在肝癌发展进程中的具体功能并不清楚，其与肝癌患者预后的关系也未见报道。Cystatin B简称CSTB，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的一员，可以抑制包括半胱氨酸蛋白酶在内的多种蛋白水解酶的活性。M.J. Lee等人利用基因芯片鉴定了248个基因在HCC和癌旁组织中的差异表达，运用Northern blot以及Real-time PCR证实，在45例HCC样本中，有36例（80%）患者CSTB的水平在癌中明显高于癌旁。更为重要的是，血清中CSTB的水平在HCC患者中明显高于非恶性慢性肝病患者。这些结果提示，CSTB联合AFP可能作为更敏感的HCC分子诊断标志物。然而，CSTB在肝癌中的表达情况及在肝癌中的生物学作用尚不十分清楚，与肝癌患者预后也有待进一步研究。本课题旨在检测PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表达，研究其在肝癌细胞中的生物学作用，利用临床随访资料分析PSMD4/UBD/CSTB在肝癌预后判断中的应用前景，探讨其作为治疗靶点的可行性，为后续转化医学研究奠定基础。研究方法：1.基因表达谱芯片筛选与确认待研基因；2.利用Real-time PCR和Western blot分别检测不同肝癌细胞系/肝癌病人中PSMD4/UBD/CSTB的mRNA水平和蛋白水平；运用免疫组织化学染色在人的组织切片和肝癌组织芯片中进一步验证PSMD4/UBD/CSTB表达情况；3.对103例肝癌组织预后芯片行PSMD4/UBD/CSTB免疫组化染色，并对染色情况进行评分，结合临床病理预后资料，统计分析PSMD4/UBD/CSTB作为肝癌预后及治疗靶标的价值；4.构建过表达质粒，包装慢病毒，通过瞬时转染实验和建立稳定细胞系，初步探讨PSMD4/UBD/CSTB在肝癌细胞恶性生物学行为中的作用；具体包括：利用CCK8试剂测定细胞增殖情况；利用transwell检测肝癌细胞迁移能力的变化；用Spheroid成球实验检测肝癌干细胞表型的变化；利用常规化疗药物5-氟尿嘧啶，用Annexin V Kit流式检测细胞凋亡情况。研究结果：1.本科室前期研究中利用基因表达谱芯片检测了70例肝癌患者癌与癌旁组织中基因的表达差异，筛选出了三个在肝癌中异常表达的基因：PSMD4、UBD和CSTB；2. PSMD4/UBD/CSTB在肝癌临床样本中mRNA水平和蛋白水平的表达均是癌中高于癌旁；3. PSMD4/UBD/CSTB在肝癌组织中的表达与肝癌病人的无瘤生存期和总体生存期有关，可以作为肝癌预后指标；4. PSMD4和UBD均能促进细胞增殖，并能显著抑制细胞凋亡；而CSTB可能更多地影响细胞的增殖能力，对抑制凋亡不起作用；5. PSMD4促进肝癌细胞的自我更新能力和转移潜能；6. PSMD4在正常组织中不表达或表达很低以及其在多种肿瘤中高表达，提示PSMD4在肿瘤治疗中的应用前景。结论：本课题利用基因表达谱芯片筛选出一组在肝癌中异常表达的与蛋白质降解相关的基因PSMD4/UBD/CSTB，高通量检测PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表达并利用大样本验证；联系临床随访资料分析PSMD4/UBD/CSTB作为肝癌预后靶标的价值，初步探讨了PSMD4/UBD/CSTB在在肝癌细胞中的生物学作用，并将我们的研究重点锚定在与Gankyrin同属人26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基的PSMD4，深入研究PSMD4对肝癌恶性表型的影响，探讨其作为肝癌治疗靶点的可行性。目前正在建立PSMD4肝细胞条件性基因敲除小鼠，下一步将深入研究PSMD4在肝癌发生发展中的作用及分子机制。