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Zhangfei又称CREBZE或者SMILE，属于CREB/ATF超蛋白家族成员，是一种碱性亮氨酸拉链转录调节因子，参与单纯胞疹病毒的潜伏、细胞凋亡以及内质网应激和未折叠蛋白反应。目前发现Zhangfei和卵泡闭锁可能存在一定的关系，在闭锁卵泡中凋亡的颗粒细胞上发现有Zhangfei特异性染色。但是，Zhangfei在生殖发育过程中的作用目前还没有报道。本研究通过构建小鼠Zhangfei基因shRNA和过表达重组慢病毒载体并进行慢病毒包装，实现Zhangfei基因在细胞中的表达抑制和过表达进一步探讨Zhangfei在卵巢闭锁过程中的作用。根据NCBI中小鼠Zhangfei基因序列，用慢病毒载体pCD513B构建包含Zhangfei cDNA全长的过表达载体，用慢病毒干扰载体pCD513B-U6构建针对Zhangfei基因的shRNA干扰序列和用于干扰对照的无意义序列的干扰载体。将穿梭质粒和包装质粒共转染HEK293细胞，包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293细胞，检测病毒滴度，再用慢病毒感染NIH3T3细胞，利用RT-PCR和Western Blotting方法检测Zhangfei的表达。试验结果如下：1、用预先设计好的引物，采用反转录和RCP扩增，从小鼠卵巢组织中扩增出Zhangfei基因开放阅读框，经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示在1400bp处有有一条阳性目的条带。并对所得扩增片段进行测序，得到结果与GeneBank中记载的相一致。将穿梭载体pCD513B经酶切鉴定后，与扩增的Zhangfei基因片段连接，获得重组慢病毒过表达载体质粒pCD513B-Zhangfei。将pCD513B-Zhangfei质粒经酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳获得一个8100bp和1400bp大小的特异性片段，表明重组载体构建成功。2、以Zhangfei基因ORF区为shRNA靶基因，设计合成4对具有短发夹结构的两条寡核酸序列，经退火形成互补双链，再克隆至慢病毒载体质粒pCD513B-U6上，构建Zhangfei基因重组慢病毒干扰载体并命名为pCD513B-U6-shRNA-Zhangfei。通过设计引物对pCD513B-U6-shRNA-Zhangfei载体进行PCR扩增鉴定，然后进行琼脂糖凝胶电泳，得到一个350bp大小的片段，表明Zhangfei慢病毒干扰载体构建成功。3、将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与包装质粒共转染HEK293细胞，生产出重组慢病毒，测定其病毒滴度为5~10×107TU/ml。4、Zhangfei慢病毒过表达载体感染NIH3T3细胞，使该细胞Zhangfei蛋白的表达水平明显升高，而携带shRNA序列的慢病毒能够显著抑制其表达，干扰效率在70%左右。针对小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰重组慢病毒制备成功，为进一步研究Zhangfei在卵巢闭锁及其功能的研究方面奠定了基础。