目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原体(Mycoplasma pneumoniae)、泰泽氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)等七种病原体是我国实验动物微生物质量控制需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体。目前对实验动物携带的病原体主要依靠分离纯化培养、菌落形态、镜下观察及生化试验等方法进行鉴定,检测周期长,费用高,并且需要有经验的检测人员进行判定,漏检、误判时有发生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技术以其简便、快速、准确等优点已广泛用于医疗和卫生行业,但实验动物的微生物质量控制还未将PCR检测方法纳入,更没有多重PCR方法,这已成为多种病原体或大样本简单、快速、准确鉴定的掣肘。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等优点。用于实验动物病原微生物检测,可以同时检测多种病原体,适合大样本的检测与鉴定,具有高灵敏性、高特异性和低成本等优点。多重PCR在其他行业应用较多,然而,目前应用在实验动物病原微生物检测的研究很少。本研究目的是针对七种实验动物病原菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌、肺炎克雷伯杆菌,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法或血清学方法比较,验证多重PCR检测方法的可操作性和准确性。方法:1、标准菌株的培养和DNA提取:将金黄色葡萄球菌标准株接种到SP琼脂培养基,绿脓杆菌标准株接种到NAC琼脂培养基,肺炎克雷伯杆菌接种到dhl琼脂培养基,37℃培养18-24h;多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌接种到血琼脂培养基,37℃培养24-48h;肺支原体接种到液体培养基中,一周后进行观察收集。按照细菌提取试剂盒方法提取各种病原体的dna,泰泽氏菌dna由中国食品药品检定研究院惠赠。2、引物的设计:通过查阅文献和primer5.0软件设计金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌的特异性引物,使用blast分析引物特异性;进行pcr扩增,测序鉴定。3、特异性实验和敏感性实验:pcr扩增非目的菌进行特异性实验;将模板dna按照10倍的比例进行梯度稀释,检测pcr敏感性。4、四组多重pcr检测方法的建立和初步应用4.1将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,同时加入16srrna的引物作为内质控,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性。应用该多重反应体系检测人工感染的粪便样本和76例新鲜大、小鼠粪便样本,同时采用传统检测方法进行检测。4.2将多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体三种病原微生物在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.3将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体五种病原微生物在同一个反应体系中扩增,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系,应用该多重反应体系检测人工感染病原菌的粪便、气管分泌物、棉拭子和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。4.4将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽氏菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测112例实验动物粪便样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。结果:1、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌在琼脂培养基上生长,肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。2、获得10对特异性引物,并通过blast比对验证引物的特异性,扩增产物大小分别为金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、肺炎克雷伯杆菌(368bp)、通用引物(520bp)、多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)、肺支原体(266bp)、泰泽氏菌(639bp)、绿脓杆菌(197bp),扩增产物测序结果均与genebank中相应序列一致。3、pcr特异性和敏感性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性。敏感性实验:金黄色葡萄球菌dna检测最低限为1pg;绿脓杆菌dna检测最低限为10pg;肺炎克雷伯杆菌dna检测最低限为10pg;多杀巴氏杆菌dna检测最低限为1pg;支气管鲍特杆菌dna检测最低限为10pg;肺支原体dna检测最低限为1pg;泰泽氏菌dna检测最低限为100pg,对应的拷贝数600copies/μl。4、四组多重pcr检测方法:4.1建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、肺炎克雷伯杆菌(368bp)和16srrna(520bp)的多重pcr检测方法。应用多重pcr方法检测人工感染病原菌样本,检测结果均阳性;76份大、小鼠粪便样本多重pcr检测结果显示1份小鼠粪便样本绿脓杆菌阳性,其余样本检测阴性;传统培养检测方法检测结果与多重pcr检测结果一致。4.2建立多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)、肺支原体(266bp)的多重pcr检测方法;应用多重pcr方法检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔棉拭子样本多重pcr检测结果19例兔棉拭子样本多杀巴氏杆菌阳性,9例大鼠棉拭子肺支原体阳性;多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌传统培养检测方法检测结果全部阴性,肺支原体血清学方法检测9例阳性。4.3建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)和肺支原体(266bp)的多重pcr检测方法;应用多重pcr方法检测人工感染的粪便、气管分泌物和棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔粪便和棉拭子样本多重PCR检测结果1例小鼠粪便绿脓杆菌阳性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR结果一致,肺支原体血清学方法检测肺支原体全部阴性。4.4建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(197bp)和泰泽氏菌(639bp)的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测112例大小鼠、兔粪便样本检测结果全部阴性,传统培养鉴定方法检测金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌结果阴性,血清学方法检测泰泽氏菌全部阴性。结论:针对七种病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌和肺炎克雷伯杆菌,根据病原菌特点和检测取材方法,分别建立了四组多重PCR检测方法。四种组合均有良好的敏感性和特异性,人工感染的样本均检测结果阳性。多重PCR检测方法的初步应用显示,多重PCR具有良好的可操作性和准确性,检测结果与传统培养或血清学检测方法一致,有些样本传统培养方法或血清学检测方法未检测出的,但多重PCR体系检测出阳性结果。本方法的建立为今后多重PCR应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。