论文部分内容阅读
目的:肺癌是当前死亡率最高的恶性肿瘤之一。已证实外源性致癌物导致肺部发生慢性炎症反应是肺癌发生的重要途径之一。慢性炎症诱导免疫抑制微环境形成在肺癌发生中起重要作用,这一肿瘤相关免疫抑制微环境包括髓源抑制性细胞（MDSCs）,调节性T细胞（Tregs）,肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）,调节性树突状细胞（DCregs）,基质细胞和肿瘤细胞。另外,IL-10,PGE2,TGF-β等细胞因子在免疫抑制微环境中也发挥重要作用。研究发现,肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar type-Ⅱ cells,AT-Ⅱ）作为肺组织重要的干细胞,在肺组织发挥重要的免疫调节作用。AT-Ⅱ细胞可以上调MHC-Ⅱ的表达而发挥抗原提呈作用,但是由于缺失激活效应性CD4+T细胞所必须的CD80和CD86,AT-Ⅱ细胞只能诱导幼稚CD4+T细胞分化成Tregs,发挥致肺免疫耐受作用。有研究报道肠上皮细胞高表达MHC-Ⅱ诱导Tregs细胞分化和浸润而参与肿瘤的发生。我们最近研究发现灌胃黄曲霉毒素G1（AFG1）诱导肺部慢性炎症反应介导肺癌发生中,AT-Ⅱ细胞来源的肺腺癌细胞高表达MHC-Ⅱ,并伴随着Tregs细胞的浸润增加。给予TNF-α体外模拟炎症环境,发现AT-Ⅱ细胞上调MHC-Ⅱ,COX-2,IL-10和TGF-b的表达。有文献报道慢性炎症可以激活肺组织上皮细胞NF-κB通路,可能通过调控Tregs浸润,促进肺癌发生。但是,到目前为止AT-Ⅱ细胞在肺癌发生中的免疫调控作用还不清楚,AT-Ⅱ来源的肺腺癌细胞是否通过上调MHC-Ⅱ表达进而参与Tregs分化和浸润仍需进一步阐明。为进一步揭示肺癌发生中AT-Ⅱ细胞上调MHC-Ⅱ表达与Tregs浸润的关系,我们收集68例临床肺腺癌标本和30例肺鳞癌标本,采用免疫组化方法检测人组织相容性抗原HLA-DR,β2微球蛋白,CD74,炎症相关细胞因子TNF-a,IL-6,COX-2以及Tregs细胞标志蛋白FOXP3的表达,并分析腺癌细胞和鳞癌细胞中MHC-Ⅱ的表达与Tregs细胞浸润的关系。另外,我们腹腔给予小鼠乌拉坦,构建TNF-α/NF-kB通路介导的慢性炎症相关肺腺癌模型,分别检测癌前病变期（肺慢性炎症期）和肺腺癌组织中AT-Ⅱ上皮细胞中MHC-Ⅱ表达情况以及和Tregs浸润情况,在动物整体水平上进一步探讨炎症介导肺腺癌发生中,AT-Ⅱ细胞来源的肺腺癌细胞高表达MHC-Ⅱ与Tregs浸润的关系。方法:1采用免疫组织化学方法,检测68例肺腺癌和30例鳞癌标本HLA-DR、CD74、β2、TNF-α、IL-6、COX-2的表达情况,分析其与临床病理特征的关系。分析肺腺癌中HLA-DR和FOXP3蛋白表达的关系,20例肺组织作为对照。统计分析运用SPSS13.0软件,采用χ2检验、Fisher确切概率法及相关分析。2应用乌拉坦诱导的慢性炎症相关的肺腺癌小鼠模型,分析在乌拉坦诱发的炎性肺组织和肺腺癌中MHC-Ⅱ,CD74,Tregs的特异性标记物FOXP3,TNF-α和p-NF-kB的表达情况。结果:1 HLA-DR、CD74、β2蛋白表达及其临床意义1.1 HLA-DR、CD74、β2蛋白表达情况HLA-DR、CD74、β2蛋白的阳性反应定位于细胞浆,出现棕黄色颗粒。HLA蛋白在20例正常肺组织中有1例阳性表达,阳性表达率为5%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为57.4%和10%。HLA-DR蛋白的阳性表达率肺腺癌明显高于鳞癌（P<0.05）。CD74蛋白在20例正常肺组织中有2例阳性表达,阳性表达率为10%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为85.3%和10%。CD74蛋白的阳性表达率肺腺癌明显高于鳞癌（P<0.05）。β2蛋白在20例正常肺组织中有2例阳性表达,阳性表达率为10%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为67.6%和20%。β2蛋白的阳性表达率肺腺癌明显高于鳞癌（P<0.05）。1.2肺腺癌和鳞癌HLA-DR、CD74、β2蛋白表达的临床病理学意义肺腺癌HLA-DR蛋白在高/中分化组的阳性表达率为67.4%,明显高于低分化组的表达率36.4%（P<0.05）,但其表达与患者年龄、性别及淋巴结转移均无关（P>0.05）。肺鳞癌HLA-DR蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及淋巴结转移均无关（P>0.05）。研究结果显示,肺腺癌和鳞癌的临床病理学意义有差异。HLA-DR蛋白过表达与肺腺癌肿瘤分化程度相关,分化程度越低,表达越低,而与肺鳞癌肿瘤分化程度无关。肺腺癌和鳞癌CD74、β2蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及淋巴结转移均无关（P>0.05）。2肺腺癌中HLA-DR和FOXP3蛋白表达的关系在肿瘤细胞阳性表达HLA-DR的肺腺癌病例中,FOXP3蛋白阳性表达的淋巴细胞明显增多,肺腺癌中HLA-DR与FOXP3表达存在正相关关系（r=0.396,P=0.001）。结果表明,肺腺癌细胞高表达HLA-DR可能促进Tregs细胞的分化和浸润。3 TNF-α、IL-6、COX-2蛋白表达及其临床意义3.1 TNF-α、IL-6、COX-2蛋白表达情况TNF-α、IL-6、COX-2蛋白阳性反应定位于细胞浆,出现棕黄色颗粒,TNF-α蛋白在20例正常肺组织中有1例阳性表达,阳性表达率为5%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为82.4%和60%。TNF-α蛋白的阳性表达率在肺腺癌中明显高于鳞癌（P<0.05）。肺腺癌和鳞癌TNF-α蛋白的阳性表达率明显高于正常肺组织（P<0.05）。IL-6蛋白在20例正常肺组织中有1例阳性表达,阳性表达率为5%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为39.7%和33.3%。两者之间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。COX-2蛋白在20例正常肺组织中有2例阳性表达,阳性表达率为10%,肺腺癌和鳞癌的阳性表达率分别为92.6%和86.7%。两者之间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。3.2肺腺癌和鳞癌TNF-α、IL-6、COX-2蛋白表达的临床病理学意义肺腺癌和鳞癌TNF-α、IL-6、COX-2蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度及淋巴结转移均无关（P>0.05）。4肺腺癌中TNF-α与HLA-DR蛋白表达的关系免疫组化结果显示,肺腺癌细胞高表达Ⅱ型肺泡上皮细胞标志物SP-C,在HLA-DR和CD74阳性表达腺癌细胞上,TNF-α、IL-6、COX-2呈阳性表达。TNF-α与HLA-DR存在正相关关系（r=0.459,P=0.000）。研究结果表明:Ⅱ肺泡上皮细胞来源的肺腺癌细胞高表达炎症细胞因子TNF-α可能与HLA-DR上调表达密切相关。5 MHC-Ⅱ和FOXP3在乌拉坦诱导的慢性炎症组织中的表达情况给予乌拉坦处理组小鼠肺炎症组织切片HE染色表现为:肺泡壁增厚,间隔增宽,出现炎症细胞浸润和肺泡上皮增生表现,呈现慢性炎症反应改变。免疫组织化学染色结果显示:乌拉坦组小鼠肺组织中巨噬细胞标志物CD68,TNF-α和p-NF-kB表达增加。结果表明腹腔给予乌拉坦可以诱导小鼠肺泡壁慢性炎症反应。进一步免疫组化结果显示:调节性T淋巴细胞标志物FOXP3阳性细胞浸润增加,肺泡上皮细胞MHC-Ⅱ高表达。提示在乌拉坦诱导的TNF-α/NF-kB通路介导慢性炎症反应中,AT-Ⅱ细胞上调MHC-Ⅱ可能与Tregs浸润密切相关。6 MHC-Ⅱ和FOXP3在乌拉坦诱导的肺腺癌组织中的表达情况给予造模半年后,7例给予乌拉坦诱导半年的小鼠动物模型全部出现肺腺癌,而7例对照组小鼠未见肺肿瘤发生。免疫组化结果显示肺腺癌组织高表达AT-Ⅱ细胞标志物SP-C,揭示乌拉坦诱导的肺腺癌细胞来源于AT-Ⅱ;肿瘤细胞同时高表达MHC-Ⅱ,提示AT-Ⅱ细胞上调MHC-Ⅱ表达可能参与肺腺癌的发生。在乌拉坦诱导的肺腺癌组织中,肿瘤细胞高表达TNF-α,p-NF-kB和COX-2等炎症相关指标,这提示TNF-α/NF-κB信号途径的激活可能在慢性炎症促进肿瘤发生中起到了重要作用。AT-Ⅱ细胞来源的肺腺癌细胞高表达MHC-Ⅱ和CD74,进一步提示炎症细胞因子可能上调AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ的表达而参与肺腺癌的发生。FOXP3是Tregs细胞的标志性分子。免疫组化结果显示,在乌拉坦诱导肺腺癌周边组织淋巴细胞中FOXP3阳性细胞数明显增多,提示炎症相关肺腺癌组织中Tregs细胞浸润增加。综合以上结果表明,在乌拉坦诱导肺组织慢性炎症反应中,TNF-α可能促进AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ,进而诱导Tregs细胞分化和浸润,最终参与肺腺癌的发生。结论:1人组织相容性抗原HLA-DR及其长链蛋白CD74和β2蛋白在肺腺癌组织中表达明显高于在肺鳞癌组织以及正常组织,提示AT-Ⅱ细胞来源的肺腺癌细胞高表达MHC-Ⅱ。2肺腺癌组织高表达HLA-DR与T淋巴细胞高表达Tregs标志物FOXP3具有明显相关性,提示肺腺癌细胞高表达HLA-DR可能促进Tregs细胞的分化和浸润。3 Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的肺腺癌细胞高表达炎症细胞因子TNF-α与HLA-DR高表达具有明显相关性,肿瘤微环境中TNF-α可能上调AT-Ⅱ细胞HLA-DR的表达。4在乌拉坦诱导的TNF-α/NF-kB通路介导肺慢性炎症反应中,肺泡上皮高表达MHC-Ⅱ,淋巴细胞中FOXP3阳性细胞数增加,提示AT-Ⅱ细胞上调MHC-Ⅱ可能与Tregs浸润密切相关。5在乌拉坦诱导的TNF-α/NF-kB通路介导肺慢性炎症相关肺腺癌中,AT-Ⅱ细胞来源的肺腺癌细胞高表达TNF-α,p-NF-kB和COX-2,MHC-Ⅱ和CD74,肺组织淋巴细胞中FOXP3阳性细胞数明显增加。6结果提示,慢性炎症反应介导肺癌发生中,炎症微环境可能促进AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ,进而诱导Tregs细胞分化和浸润,而参与肺腺癌的发生。