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研究目的癌症的发病率与死亡率的居高不下,使得开发新的癌症治疗药物变得迫在眉睫。90%以上的癌症病人死于肿瘤转移及其并发症。其中,肿瘤细胞中的表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor,EGFR)的过表达或异常活化与肿瘤细胞从良性到恶性的转变、癌症病人的不良预后均密切相关。目前已经有以EGFR为靶点的抗肿瘤临床用药,然而,绝大多数的抑制剂在使用后都出现了不同程度的耐药现象。因此,开发新的能抑制EGFR介导的肿瘤转移药物意义非常重大。乌贼墨多糖(polysaccharide of Sepeiella maindroni ink,SIP)是本课题组从曼氏无针乌贼的墨汁中分离得到的一种酸性多糖,具有抗突变诱导的作用。经过氯磺酸-甲酰胺法对其进行了硫酸化修饰,得到了硫酸化乌贼墨多糖(sulfated polysaccharide of Sepiella moindroniink,SIP-SII)。在体外,SIP-SII 对卵巢癌细胞SKOV-3的细胞活力没有明显影响,却可以显著抑制细胞迁移及侵袭,还可以诱导细胞的凋亡。此外,SIP-SII还可以明显的降低SKOV-3细胞中MMP-2的表达及活性。体内活性研究表明,SIP-SII可以抑制S180肉瘤的生长,还可以显著降低B16F10人工肺转移以及抑制血管生成。前期研究结果表明,SIP-SII有望开发成一个安全的抗肿瘤转移新药。然而,对其作用机制的不明确限制了对SIP-SII的进一步开发利用。为此,本课题通过研究SIP-SII在肿瘤细胞上的定位,对可能的作用靶点进行筛选,而后,对信号通路进行分析,以期探知SIP-SII的抗肿瘤转移活性机制。研究方法1 SIP-SII与细胞结合定位及对ErbB家族中EGFR的表达及活性的影响将SIP-SII进行FITC标记。而后,运用流式细胞术检测SIP-SII-FITC与细胞的结合。通过激光共聚焦显微镜技术,观察SIP-SII-FITC在不同细胞内的位置,与特异性的膜染料及核染料进行共定位,得出SIP-SII在给药后,处在细胞什么位置。运用Western blot法检测了 SIP-SII对ErbB家族中4种蛋白质的表达的影响,并检测了 SIP-SII对磷酸化EGFR的作用。运用RT-PCR技术检测了 SIP-SII对EGFR mRNA水平的影响。2 SIP-SII与EGFR之间的亲和力以及对EGF刺激的细胞迁移及侵袭的影响运用激光共聚焦显微镜技术检测SIP-SII与EGFR的细胞内共定位,而后用SPR技术检测SIP-SII与EGFR之间的亲和力。运用Western blot法检测了 SIP-SII对EGF刺激的EGFR活化以及MMP-2、MMP-9表达上调的作用。运用划痕愈合实验及基质胶侵袭实验分别检测了 SIP-SII对EGF诱导的肿瘤细胞的迁移及侵袭的影响。3 SIP-SII对PI3K/Akt/mTOR和MAPKs信号通路及核转录因子的作用运用 Western blot 方法检测了 SIP-SII 对 PI3K/Akt/mTOR 及 MAPKs 信号通路中的关键激酶PI3K、Akt、mTOR、JNK、ERK及p38MAPK的磷酸化水平的影响。此外,还用同样的方法检测了 SIP-SII对EGF刺激的EGFR、Akt、JNK、ERK及p38MAPK磷酸化的作用。随后,检测了 SIP-SII对NF-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2表达的影响,以及对EGF刺激的NF-κB、AP-1的核转位的作用。4 SIP-SII对信号通路的抑制及其抗肿瘤转移活性间的关系采用划痕愈合实验、transwell小室迁移实验及基质胶侵袭实验检测SIP-SII的抗肿瘤迁移及侵袭活性与各通路抑制剂之间的关系。运用Western blot及RT-PCR实验检测SIP-SII对MMP-2的表达的作用及SIP-SII与各通路抑制剂联合给药时MMP-2的表达的变化。研究结果1 SIP-SII与细胞膜结合且抑制EGFR的表达及磷酸化FITC可以以低取代度的方式对SIP-SII进行标记。SKOV-3细胞可以浓度依赖性地与SIP-SII结合。结合后,绝大多数的SIP-SII并不会穿过细胞膜,而是结合在细胞膜上。SIP-SII对细胞膜上的ErbB家族蛋白中的EGFR的蛋白表达有显著的抑制作用,对其它三种,即ErbB2、ErbB3和ErbB4的表达没有明显的影响。对于磷酸化的EGFR,SIP-SII同样具有显著的抑制作用。SIP-SII对EGFR的转录也有显著的抑制作用,表现为SIP-SII显著的降低了 SKOV-3细胞中的EGFR的mRNA水平。2 SIP-SII可与EGFR结合且可抑制EGF刺激的EGFR活化及肿瘤细胞迁移、侵袭及MMP-2表达SIP-SII在细胞内可以与EGFR实现共定位,且可以与重组的EGFR蛋白结合。在EGFR过表达细胞系中,SIP-SII可以显著抑制EGF刺激的EGFR自身磷酸化。对EGF刺激的肿瘤细胞迁移、侵袭及MMP-2表达上调,SIP-SII均有显著的阻断作用。不过,SIP-SII对EGF诱导的KB细胞中MMP-9的表达没有明显的影响。3 SIP-SII可以下调PI3K/Akt/mTOR及p38 MAPK信号通路活性、阻断EGF对这两条信号通路的激活作用及降低核转录因子NF-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2的表达SIP-SII显著地抑制PI3K/Akt/mTOR及p38 MAPK的磷酸化,对JNK及ERK的磷酸化则没有明显的作用。对于EGF刺激引起的信号通路活化,SIP-SII可以明显地阻断EGF诱导的EGFR与PI3K/Akt/mTOR及p38 MAPK的活化。而对EGF的激活JNK及ERK作用,SIP-SII没有明显的作用。SIP-SII对NF-κB、AP-1(c-Jun及c-Fos)和AP-2的表达均有抑制作用。此外,SIP-SII可以阻断EGF诱导的NF-κB和c-Jun核转位,对EGF诱导的c-Fos核转位没有影响。4 SIP-SII通过下调PI3K/Akt及p38 MAPK抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭SIP-SII与PI3K、mTOR及p38 MAPK的抑制剂在抑制SKOV-3细胞的迁移及侵袭、抑制MMP-2的表达上,均有协同作用。SIP-SII与EGFR、PI3K及p38 MAPK的抑制剂在阻断EGF刺激的KB细胞的迁移及侵袭上,也表现出协同作用。结论(1)SIP-SII给药后主要与肿瘤细胞的细胞膜结合,而不是进入细胞。而且,SIP-SI1对膜上EGFR蛋白的表达及活性产生抑制作用。(2)SIP-SII可以与EGFR蛋白结合,而且能抑制EGF刺激的EGFR活化、肿瘤细胞迁移侵袭以及MMP-2表达的上调。(3)SIP-SII能够抑制PI3K/Akt/mTOR和p38 MAPK信号通路及其下游核转录因子NF-κB、AP-1和AP-2。对于EGF激活的PI3K/Akt和MAPKs信号通路及核转录因子的核转位,SIP-SII降低PI3K/Akt及p38 MAPK信号通路的活性和NF-κB、c-Jun的核转位。(4)SIP-SII是通过降低PI3K/Akt/mTOR和p38 MAPK信号通路的活性来抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭、MMP-2的表达以及EGF诱导的肿瘤细胞迁移和侵袭。