斜纹夜蛾未知基因Slun17超表达载体的构建及其功能初探

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PiggyBac转座系统在转基因昆虫中已广泛使用,并已证实能在斜纹夜蛾中成功转座。斜纹夜蛾属鳞翅目昆虫,是一种世界性分布的害虫。Slun17基因是斜纹夜蛾中肠中克隆出来的新基因,其具体功能暂不清楚。本研究在比较以胞质肌动蛋白A3启动子构建的pigA3EGFP和眼部与神经特异性3×p3启动子构建的pig3×p3EGFP两种载体,在斜纹夜蛾转基因筛选效率的基础上,将Slun17基因连接到上述两种载体中构建Slun17超表达载体,并将超表达载体注射入斜纹夜蛾早期受精卵,实现Slun17的超表达。通过形态观察,免疫组化等方法分析Slun17基因超表达对幼虫发育的影响,并分析该基因在抗斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)间的可能作用。结果如下:  1)用实验室早期建立的斜纹夜蛾转基因体系,将pigA3EGFP和pig3×p3EGFP表达载体注入斜纹夜蛾受精卵中。注射pigA3EGFP载体,24h后40%(2020/5050)的注射卵表达出绿色荧光蛋白(EGFP);96h后孵化出的幼虫中有16%(33/210)的G0代幼虫表达EGFP。注射pig3×p3EGFP载体后,表达EGFP的荧光卵和G0代幼虫分别为21%(945/4500)和1%(1/102)。统计分析表明:pigA3EGFP载体在卵和G0代幼虫的荧光率显著高于pig3×p3EGFP载体(P<0.01)。  2)对筛选到的G0代幼虫提取基因组DNA,PCR检测不同龄期幼虫的基因组DNA,结果发现:受精卵及2龄前幼虫均可检测到EGFP基因,而4龄及4龄后幼虫未扩增出EGFP条带。  3)将未知基因Slun17分别连接到pigA3EGFP和pig3×p3EGFP载体上,命名为S/un17-pigA3EGFP和Slun17-pig3×p3EGFP表达载体,载体大小分别为7722bp和8025bp。将上述超表达质粒显微注射入斜纹夜蛾早期受精卵中,Slun17-pigA3EGFP注射后有14.4%(163/1130)的受精卵表达EGFP,GO代幼虫的荧光率为3.5%(2/57);Slun17-pig3×p3EGFP注射后卵表达荧光的比例仅为3.3%(180/5500),无荧光幼虫孵化。统计分析表明:Slun17-pigA3EGFP表达质粒在受精卵和幼虫中的荧光率显著高于Slun17-pig3×p3EGFP(P<0.01)。  4)从注射Slun17-pigA3EGFP表达载体卵中孵化出的两条荧光幼虫,生长较野生型明显缓慢;免疫组化结果显示,过表达Slun17基因的GO代幼虫其中肠内壁组织明显较野生型增厚。  5)对野生型4龄初期幼虫喂食斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV),发现受SpltMNPV感染后的幼虫,其体内SLUN17蛋白表达上调。  综上所述,斜纹夜蛾Slun17基因可能与食物中营养的吸收和抗病毒有关,该基因的过表达导致中肠内壁增厚影响营养的吸收和个体生长,并可能会阻止病毒通过肠壁侵入机体。
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