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Toll样受体属于天然免疫因子,在感染初期通过识别病原体相关分子模式,启动信号传递发挥抗感染作用,从而清除病原微生物的侵害。鹅是我国饲养较多的水禽之一,因生长环境的影响,易发生禽流感等传染性疾病,现有疫苗不能提供全部的保护作用,从天然免疫角度增强抗病性已经成为研究的热点。目前在哺乳动物中对于TLRs的研究较为广泛,在禽类中尤其是鹅TLR4的研究较少。本试验拟对三花鹅TLR4基因胞外区进行克隆和序列分析,在H5亚型禽流感疫苗诱导下,采用免疫组织化学方法和半定量PCR技术对三花鹅TLR4及相关免疫因子的表达情况进行初步分析,探究TLR4免疫功能发生机制,结果如下:(1)克隆三花鹅TLR4基因胞外区片段,大小为998 bp,编码304个氨基酸残基;与已知朗德鹅序列比对发现,共有9个核苷酸突变位点,导致2个氨基酸位点发生改变。核苷酸及氨基酸进化树分析发现,三花鹅TLR4与朗德鹅和马岗鹅同源性最高,在禽类中较为保守,与哺乳类、鱼类等同源性较低,具有种属特异性。(2)构建三花鹅TLR4胞外区重组表达载体,表达的重组蛋白大小约为38 kD;利用切胶纯化方法获得特异性蛋白免疫家兔,得到兔抗鹅TLR4胞外区多克隆抗体,ELISA检测血清效价达到1:10~4,Western Blot方法验证为特异性TLR4条带。(3)利用生物信息软件分析鹅TLR4蛋白胞外区序列特征,胞外区由6个亮氨酸重复序列LRR组成,具有信号肽,属于分泌蛋白,有30个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲居多。(4)在H5亚型禽流感疫苗诱导下,采用半定量PCR技术检测三花鹅TLR4及相关免疫因子mRNA在不同组织中的转录水平,结果显示:TLR4在脾脏、骨髓、心脏和胸腺中的表达量实验组高于对照组,肺和法氏囊中对照组高于实验组;IL-1β、IL-6和IFN-γ实验组表达量均高于对照组;实验组IFN-α在法氏囊的表达量与对照组相比稍有下调,在其他组织中的表达量实验组高于对照组。表明H5亚型疫苗免疫鹅体后,TLR4及相关免疫因子被激活表达,参与了抗感染的过程。(5)在H5亚型禽流感疫苗诱导下,用免疫组织化学方法检测TLR4蛋白在不同组织中的表达情况,结果表明:TLR4蛋白在脾脏中的表达量最高,在心脏、肝脏和肾脏中TLR4蛋白表达实验组高于对照组,在肺和法氏囊中对照组表达量高于实验组。综上所述,本试验首先克隆了三花鹅TLR4基因胞外区序列,获得了重组蛋白及多克隆抗体;在H5亚型禽流感病毒疫苗诱导下,对三花鹅TLR4及相关免疫因子在不同组织的表达规律进行了分析。本研究为鹅TLR4免疫功能的研究奠定了基础,同时也为禽类TLR信号转导途径的分析提供了理论依据。