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背景和目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫疾病,最常累及部位为脑室周围白质、视神经、脊髓等。其病因及发病机制迄今不明,目前观点认为,携带先天遗传易感基因的个体,在后天环境中,因病毒感染、外伤等外因的作用下,诱导中枢髓鞘成分发生异常自身免疫应答而致病。目前传统的治疗方法如糖皮质激素、干扰素β等,虽然可以减缓MS的进展,但是,长期服用这些药物往往会导致严重的副作用。因此,寻找疗效好,副作用低的药物迫在眉睫。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能、具有抗炎和再生能力的成体干细胞,普遍存在于骨髓和其它组织中,如脐带(UC),胎儿肝脏和脂肪组织等。近年来,随着对间充质干细胞的研究不断深入,发现其不仅具有突破谱系屏障分化为神经细胞的功能,而且还可以通过抑制免疫反应、促进髓鞘再生和诱导神经损伤修复来治疗一些神经退行性疾病。本实验通过建立自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型,分别采用不同来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对EAE模型小鼠进行治疗,观察各组小鼠在治疗过程中病情轻重的变化,并通过一些实验室检查来探究其可能的机制,从而为MS的治疗提供新的思路和方法。方法:1.采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)作为抗原与完全弗氏佐剂混合免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型。在小鼠发病后随机分为对照组,模型组,UCMSC组、ADMSC组和UCMSC-SPK1组,通过尾静脉给予不同来源的间充质干细胞治疗,从发病开始后每隔七天注射一次,共3次;正常对照组和模型组用相同剂量的生理盐水替代治疗。2.采用双盲法每天对各组小鼠进行神经功能缺损评分,持续33天。3.免疫后第33天处死小鼠,取出脑和脊髓放入﹣80℃冰箱冻存。4.通过电子显微镜观察各组小鼠脊髓中髓鞘脱失情况。5.通过蛋白印迹法来检测各组小鼠脊髓中GFAP和MBP的表达。6.研磨脾脏细胞收集脾脏细胞,通过流式细胞仪检测脾脏中调节性T细胞(CD4+CD25+和foxp3+)和NK(NK1.1+CD3-)细胞的比例。7.通过携带SPK1基因的腺病毒(Ad-SPK1)转染UCMSC,运用westernblot检测UCMSC、ADMSC和UCMSC-SPK1中SPK1的表达。结果:1.MOG35-55和完全弗氏佐剂混合免疫成功制备了EAE小鼠模型。2.Westernblot结果显示,相比UCMSC,ADMSC中SPK1的表达量更高,而经过携带SPK1基因的腺病毒(Ad-SPK1)的转染,UCMSC-SPK1中SPK1的表达量比ADMSC更高。3.双盲法对各组小鼠神经功能缺损评分结果显示,与模型组相比,UCMSC组、ADMSC组和UCMSC-SPK1组小鼠的神经功能缺损评分明显降低;将这三个细胞治疗组进行比较发现,ADMSC组比UCMSC组的神经评分降低的更加明显,而相较ADMSC组,UCMSC-SPK1组小鼠的神经缺损评分下降的趋势更为显著。4.电镜下观察小鼠脊髓髓鞘脱失情况,结果表明:与正常对照组小鼠相比,模型组中小鼠脊髓的髓鞘大面积脱失;而经过细胞治疗后髓鞘脱失面积明显较少,程度显著减轻;对比三个细胞治疗组之间髓鞘脱失情况发现,相比UCMSC组,ADMSC组和UCMSC-SPK1组小鼠脊髓的改善更加明显,而这种趋势在UCMSC-SPK1组中表现的更加显著。5.Westernblot检测小鼠脊髓中星形胶质细胞活化标记蛋白GFAP的表达发现,与对照组相比,模型组小鼠脊髓中GFAP的表达明显增加,而与模型组相比,UCMSC组,ADMSC组和UCMSC-SPK1组小鼠脊髓中GFAP的表达明显降低;将这三组细胞治疗组进行比较发现,相比UCMSC组,ADMSC组和UCMSC-SPK1组中GFAP的表达降低的更加明显,而相较ADMSC组,UCMSC-SPK1组小鼠脊髓中GFAP的表达减少的更加显著。6.Westernblot检测各组小鼠脊髓中MBP的表达结果显示,与正常组相比,模型组小鼠脊髓中MBP的表达明显减少,而经过MSC治疗后,各治疗组小鼠脊髓中MBP的表达明显增高;将这三个细胞治疗组进行比较发现,ADMSC组小鼠脊髓中MBP的表达要明显多于UCMSC组,而这种趋势在UCMSC-SPK1组中表现的更为显著。7.流式细胞仪对各组小鼠脾脏中的调节性T细胞和NK细胞的比例进行测定,结果显示,相较对照组,模型组小鼠脾脏中调节性T细胞的比例明显降低,而NK细胞的比例却显著升高;经过细胞治疗后,UCMSC组,ADMSC组和UCMSC-SPK1组小鼠脾脏中调节性T细胞的比例显著升高,而NK细胞的比例显著降低;相较UCMSC组,ADMSC组和UCMSC-SPK1组中这种趋势的表现更为明显,而与ADMSC组相比,UCMSC-SPK1组中调节性T细胞升高和NK细胞降低的表现更为显著。结论:1.不同来源的间充质干细胞治疗都可以显著减轻EAE模型小鼠神经功能缺损评分,其机制可能是通过调节免疫反应,抑制神经系统炎症反应和促进髓鞘再生来实现的。2.经过SPK1基因的转染,UCMSC-SPK1在治疗EAE中表现出了比ADMSC更好的疗效,而原始的UCMSC却比ADMSC疗效差。3.不同来源的干细胞,其表达的SPK1的量不同,这可能导致了它们在治疗EAE模型小鼠疗效上的差异。