目的黑色素瘤是体表肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤,其高度侵袭转移性和对于传统化疗药物的耐药性被认为是黑色素瘤治疗和预后的最大障碍。RhoC作为肿瘤转移相关因子可通过多种转移相关机制参与肿瘤的侵袭与转移,是控制肿瘤转移的分子开关,RhoC有望成为抑制肿瘤转移的重要靶位。RNAi技术是目前公认快速有效的基因沉默方式,有利于进行基因治疗和表达缺失下的功能研究。目前多项研究证实RNAi技术可通过调节和关闭基因表达进而调控细胞的各种生命活动,但应用RNAi技术靶向RhoC基因慢病毒干扰载体的构建、RhoC基因沉默对黑色素瘤生物学行为,尤其是侵袭转移能力的影响以及对化疗药物耐药逆转性的研究尚未见报道。本研究拟利用RNAi技术,以慢病毒作为基因载体,以人黑色素瘤A375细胞作为研究对象,以转移相关基因RhoC作为靶基因,研究靶向RhoC基因慢病毒干扰载体的构建及沉默RhoC基因对体外培养A375细胞生物学行为包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞粘附能力、细胞侵袭能力的影响；肿瘤转移相关因子基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、上皮钙粘附素(E-cadherin)的表达水平的变化；以及对于治疗黑色素瘤的化疗药物氮烯咪胺(Dacarbazine, DTIC)耐药性的逆转并分析其可能机制,旨在探讨RhoC基因在黑色素瘤细胞生物学行为中的作用,为RhoC作为恶性肿瘤转移相关基因治疗靶位的可行性、为逆转肿瘤耐药及基因治疗提供实验室依据,为进一步应用RNAi技术治疗肿瘤提供新的思路。方法1根据RhoC编码区基因信息设计构建三对pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体,并转染人黑色素瘤A375细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测三对pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体对A375细胞RhoC mRNA及蛋白表达的沉默效应从而筛选出最有效的靶序列。2将RNAi效应最佳的序列进一步构建至pcDNA6.2-EmGFP-miR中并进行慢病毒包装构建形成靶向RhoC pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体,测序并感染A375细胞,进一步应用荧光定量PCR和Western blot检测对RhoC mRNA及蛋白表达的沉默效应。3体外实验中,将pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体感染人黑色素瘤A375细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测RhoC基因沉默后转移相关基因MMP-2, E-cadherin mRNA及蛋白表达：应用Transwell小室细胞侵袭实验检测A375细胞侵袭能力；应用细胞粘附实验检测对层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的粘附能力；应用MTT法检测细胞增殖；应用流式细胞仪检测细胞凋亡：应用MTT法检测对化疗药物氮烯咪胺(DTIC)耐药性的逆转率。同时应用上述各种方法对对照组相应指标进行检测。统计学处理：所有数据采用SPSS15.0统计软件进行分析。多样本均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD比较或Dunnett T3比较。以p<0.05为差异具有统计学意义。结果1构建的三对shRNA表达载体分别为pGPU6/GFP/Neo-shRNA336、pGPU6/GFP/Neo-shRNA453及pGPU6/GFP/Neo-shRNA680,应用荧光定量PCR和Western blot检测转染人黑色素瘤A375细胞后靶基因RhoC mRNA和蛋白表达水平分别为1.47±0.26、1.13±0.16、1.39±0.11和70.98±9.21、50.67±6.06、65.77±4.06,pGPU6/GFP/Neo-shRNA453为最有效干扰序列。2成功构建了靶向RhoC的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体,经测序证实序列正确；将构建的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体感染人黑色素瘤A375细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测RhoC mRNA和蛋白的表达水平分别为1.05±0.05、62.04±15.86,而阴性对照慢病毒组、正常对照组RhoC mRNA和蛋白分别为4.21±0.24、220.86±24.07和4.63±0.32、257.39±12.30,慢病毒表达载体组较对照组相比较差异具有统计学意义(p<0.05)。3体外实验中,将pLenti6.3-EGFP-453慢病毒载体感染人黑色素瘤A375细胞,应用荧光定量PCR和Western blot检测RhoC基因沉默后转移相关基因MMP-2 mRNA和蛋白的表达水平分别为1.17±0.16,66.40±14.51；而阴性对照慢病毒组、正常对照组MMP-2 mRNA和蛋白分别为2.28±0.31、112.59±23.27；2.75±0.90、135.88±26.16; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组与对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。应用荧光定量PCR和Western blot检测pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平分别为2.95±0.71、125.17±19.88；而阴性对照慢病毒组、正常对照组E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平分别为1.80±0.47、77.39±13.38; 0.97±0.54、47.91±18.69; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组与对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4体外实验中,Transwell小室细胞侵袭实验结果显示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组穿膜细胞数为40.41±8.88,较阴性对照慢病毒组、正常对照组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)；阴性对照慢病毒组穿膜细胞数为64.82±13.48,正常对照组为77.46±6.47,阴性对照慢病毒组较正常对照组轻微下降,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。结晶紫染色法细胞粘附实验结果显示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组A375细胞对层粘连蛋白(Ln)和纤维粘连蛋白(Fn)的粘附能力较慢病毒阴性对照组、正常细胞对照组明显下降,通过酶标仪测定光密度OD值,pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组对Ln和Fn的OD值分别为0.467+0.005、0.321±0.007,较阴性对照慢病毒组、正常对照组明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05)；阴性对照慢病毒组对Ln和Fn的OD值分别为0.532±0.005、0.376±0.004,正常细胞组分别为0.5444±0.008、0.381±0.007,阴性对照慢病毒组较正常对照组轻微下降,但差异不具有统计学意义(p>0.05)。5体外实验中,MTT法检测细胞增殖结果显示：24h时间点pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组吸光度为0.319±±0.004,与阴性对照慢病毒组、正常对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。72h、120h及168h时间点时,pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组吸光度分别为0.337±±0.004、0.369±±0.004和0.397±±0.005；而阴性对照慢病毒组、正常对照组吸光度分别为0.350±±0.001、0.389±±0.002、0.425±±0.006和0.355±0.003、0.404±0.005、0.440±0.010; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组的细胞增殖较两对照组下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测pLenti6.3-EGFP-453慢病毒感染人黑色素瘤A375细胞后对DTIC耐药性影响结果显示：DTIC终浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml时,慢病毒表达载体联合药物组抑制率分别为8.82%、14.01%、23.15%和33.51%；单独药物组抑制率分别为1.97%、7.79%、13.57%和20.37%,在单独使用不同药物浓度DTIC作用下,IC50值为254.99μg/ml,而联合应用pLenti6.3-EGFP-453慢病毒和药物DTIC作用下,IC50值下降为162.41μg/ml,逆转倍数为1.57倍。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒组细胞凋亡率为13.36±±0.39%,与阴性对照慢病毒组、正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),阴性对照慢病毒组细胞凋亡率为4.78±±0.45%,正常对照组为3.98±±0.41%,两对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论1成功构建的靶向RhoC基因的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体可高效感染体外培养的人黑色素瘤A375细胞,并可显著抑制靶基因RhoC mRNA和蛋白的表达。2 PLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体RhoC基因沉默后,可明显下调体外培养的人黑色素瘤A375细胞的肿瘤转移相关基因MMP-2表达,上调E-cadherin的表达。肿瘤细胞侵袭和粘附能力明显抑制。RhoC基因沉默可能通过对肿瘤转移相关基因的表达调控来实现对肿瘤侵袭转移能力的抑制作用。3 PLenti6.3-EGFP-453慢病毒表达载体RhoC基因沉默后,人黑色素瘤A375细胞增殖抑制,细胞凋亡增加,并可逆转A375细胞对化疗药物DTIC的耐药性。RNAi技术可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,诱导细胞凋亡可能是其途径之一。