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植物在受到生物或非生物的刺激后，可以启动不同的信号通路，调整其生命活动的状态，应对面临的各种挑战。由水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯介导的基本防卫信号通路可引发植物的广谱抗病性，并与植物抗虫和生长发育密切相关。脱落酸（ABA）被认为是一种逆境激素，其介导的信号通路可促使植物在逆境胁迫条件下继续生存，并在植物生长发育，抗病等过程中发挥重要作用。不同信号通路之间经常发生交叉对话，形成了复杂的信号网络。当遭遇外界各种不同的刺激时，植物会迅速启动反应机制，调用多个信号通路中相关的调控因子，重新编排形成高效的信号网络，应对面临的生存危机。植物如何根据不同的外源信号调用相关的因子，并使其“各就各位”发挥作用，是目前植物科学领域研究的重要话题。革兰氏阴性植物病原细菌产生的蛋白质激发子harpins可诱导植物多种反应，如抗病，抗虫，促生长和抗旱等。作为一种多功能激发子，它非常有利于研究植物在生长发育，抗病防卫，抗虫和抗逆等过程中的相关信号传导机制。于是，harpins如何被植物识别，如何引发各种效应，并且这些反应中有哪些信号通路参与，它们相互之间有没有交叉对话，如何交叉对话等多个问题成为了研究的重点。本硕士论文的研究目的：在前人研究的基础上，进一步明确harpin诱导的各种效应，解析相关的信号传导机制，揭示乙烯和ABA在harpin诱导的促生长，抗病抗虫过程中的交叉对话。1 Harpins启动植物信号传导机制的初步解析Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子，他们共同的特征是：富含甘氨酸，热稳定，对蛋白酶敏感，注射非寄主植物叶片可诱导HR（hypersensitive response）或HCD（hypersensitive cell death）。外源施用harpins，可诱导植物的多种表型，如抗病、抗虫、抗旱和促进生长。作为一种多效型的激发子，它如何行使它的多重功能，目前还不清楚。本研究使用来自Xanthomonas oryzae pv．oryzae的harpinxo。从信号传导角度初步解析其产生机制。首先，我们从烟草中克隆了三个受病原物诱导的启动子PPP1、PPP2和PPP3，序列分析表明三者均含有受细菌诱导的反应元件，PPP1和PPP2还含有受生物激发子和SA诱导的反应元件。通过替换35S启动子将它们构建于含报告基因G（?）的植物转化载体pBI121上，分别转化烟草和拟南芥，获得了稳定整合的转基因植株。用青枯病菌（Ralstonia solanacearum）接种转基因植株，G（?）染色表明三个启动子均可被诱导，说明克隆的启动子具有活性。随后，我们用SA、harpinXoo。及其三个具有不同功能的片段DEG（促进生长）、DIR（诱导抗虫）、DPR（诱导抗病）喷雾处理转基因植株，发现PPP1和PPP2均可被诱导，而PPP3不能，这与相关反应元件的存在与否相一致。这说明，harpins在植物上的多重效应可能是通过其特异性的功能域与PPPs中相应的顺式作用元件之间的相互作用来实现的，而且顺式作用元件与harpins功能域之间的对话可能决定了harpins起何种效应。其次，我们将编码harpinXoo的基因hpaGXoo。构建于植物转化载体pBI121上，并通过叶盘法将其转入烟草，获得表达harpinXoo的转基因株系(harpinXoo-e（?）ressing tobacoo，HARTOB)。经RT-PCR、Northern杂交和SDS-PAGE电泳检测，我们确定了harpinXoo在转基因烟草中的稳定表达，并选择表达水平分别为高、中和低的7号、6号、15号三个品系作为研究对象。用青枯菌（R．solanacearum）、烟草赤星菌（Alternariaalternata）和烟草花叶病毒（TMV）分别接种这三个品系，发现均有抗性，并与harpinXoo的表达强度正相关。检测抗病防卫相关基因的表达发现，SAR调控基因NPR1、防卫基因GST1、Chia5、PR-1a和PR-1b在不同的转基因株系中均有不同程度的表达，其中在HARTOB7中表达最强，与抗病表型一致。观察还发现所有HARTOB植株在整个生命周期都不自发macro-HR，也没有检测到micro-HR的发生和HCD标志基因hsr203J和hinl的表达，这与外用harpinXoo的效果刚好相反。根据上述结果，我们得出结论：harpinXoo转入烟草中表达可诱导植物产生广谱抗病性，但不诱发HCD，与harpins外用的效果不同，这说明harpins诱导的HCD与抗病信号通路可能各行其道。2 Harpins诱导植物促生长／抗虫和抗旱的信号传导解析乙烯信号传导可能调控了植物的生长和防卫，并随刺激的不同，参与的成分也可能不同。我们研究发现乙烯信号通路控制了harpin诱导的抗虫和促生长。用harpin溶液喷施野生型植株顶部或浸种处理拟南芥种子，都可导致促生长表型，其中后者表现为促进根生长。同样经harpin处理后的野生型植株对绿桃蚜（Myzus persicae）也具有了一定的抗性。联系SA、JA和乙烯三条激素信号通路研究发现，尽管SA可被harpin诱导，但它不引发抗虫和促生长，因为harpin可以诱导SA信号突变体促进生长和抗虫。内源JA水平在harpin处理后下降，JA信号传导不可缺少的基因COI1在处理后的植株中也没有表达，而且harpin依然可以诱导JA抗性突变体jarl-1抗虫和促生长。乙烯水平在harpin诱导抗虫和促生长过程中显著升高，同时许多与乙烯信号传导相关的基因也都有一定程度的表达。而且研究发现乙烯受体基因ETR1在这两过程中是必需的，因为突变体etrl-1可取消这两种效果。另外，用药物抑制剂阻断乙烯的感知也得到了相同的结果。EIN2和EIN5是乙烯信号通路下游的两个重要分支，HrpN处理其突变体ein2-1能诱发促生长但不能诱导抗虫，而ein5-1能诱导抗虫却不能诱发促生长。综上所述，我们认为harpin激活了乙烯信号通路，并通过下游的两个分支EIN2和EIN5分别调控了拟南芥抗虫和促生长。HrpN不仅可诱导植物促生长、抗病和抗虫，还可激活ABA信号通路引发缺水植株的抗旱作用。外源施用HrpN，可促进野生型拟南芥叶片气孔关闭，降低叶片蒸腾速率，增加叶片持水量和脯氨酸含量，并可减轻因水分缺失引起的细胞膜损伤和干旱症状，同时处理后植株内源ABA含量上升，与ABA信号传导相关的一些调控基因和效应基因rd29B表达增强。ABA信号通路突变体abil-1（ABI1磷酸酶缺陷型）经HrpN处理后的抗旱反应与野生型大致相当，而突变体abi2-1（ABI2磷酸酶缺陷型）不能被HrpN诱发这些反应。抑制野生型植株合成ABA可取消HrpN诱导的气孔关闭和干旱症状减轻。而且，HrpN处理abi2-1可诱导对Pseudomonas syringae的抗性，效果与野生型类似。所以，依赖ABI2的ABA的信号通路调控了HrpN诱导的抗旱作用，但不影响植物的抗病性。3乙烯信号和ABA信号在harpins诱导的促生长／抗虫和抗旱过程中的交叉对话基于第二部分的研究结果，我们推测乙烯信号和ABA信号在harpins诱导的促生长／抗虫和抗旱过程中可能存在交叉对话，所以我们对此开展了进一步的研究。根据野生型上的药物抑制实验，和对乙烯信号突变体、ABA信号突变体的研究发现，这些过程涉及两种激素信号的协同和差别作用。用HrpN浸种处理野生型种子可促进种子萌发和后续的根伸长生长，但这些效果可被乙烯突变体etrl-1，ABA突变体abi2-1，和抑制野生型种子合成或感知乙烯和ABA所破坏。因此，这两种激素信号在这些过程中都是需要的。当用HrpN喷施拟南芥，植株生长被促进，蚜虫的繁殖数量也有所减少。用etrl-1，和abi2-1研究发现乙烯而不是ABA在促生长和抗虫过程中是关键的，而且这一结果在野生型的药物抑制实验上也得到了验证。当拟南芥野生型和etrl-1遭遇干旱胁迫时，外源使用HrpN可诱导其抗旱反应，而abi2-1没有这种效果，同时抑制野生型植株中ABA而不是乙烯合成也可取消这种效果。另一组实验中，乙烯信号通路下游突变体ein2-1不能引发抗虫，ein5-1不能引发促生长，而ABA信号突变体abil-1在所有过程中都没有效果。所有结果显示HrpN激活的信号通路可根据植物当时面临的挑战行使不同功能。