背景癌症是全球主要死亡原因之一,根据世界卫生组织最新数据显示,在2012年造成820万人死亡。因罹患胃癌造成的死亡人数排名位居第三,仅次于肺癌和肝癌。在男性最常见确诊癌症中胃癌位居第四,同时在女性最常见确诊癌症中胃癌位居第五[1]。根据世界卫生组织-2014年癌症国家概况显示,在中国,胃癌在男性和女性中的死亡率分别占总的肿瘤死亡率的15.5%和13.3%。并且,其发病率居于第三位[2]。根据病因学和流行病学研究表明人胃组织癌变过程主要涉及以下四个阶段:慢性胃炎;萎缩;肠上皮化生;异型增生。其发生、发展与基因和环境因素的相互作用密切相关[3;4]。胃上皮细胞发生恶性转化生成恶性肿瘤的过程。而此过程中所涉及的具体机制目前并不十分清楚。因此,针对胃癌致病机制的深入研究,有助于寻找稳定可靠的生物标志物以及治疗靶点,用于胃癌的早期检测及治疗以提高患者预后。。microRNA是一类长度大约为22nt的内源性非编码RNA,通过与基因的3’UTR片段结合从而靶向调控基因的表达,参与了细胞凋亡、增殖、代谢等多个生理过程。近年来,microRNA作为肿瘤研究中的热点,一系列与胃癌发生和发展相关的 miRNAs,如 miR-25、 miR-141和 miR-22等相继被报道[5-7]。本课题组在前期基因芯片结果中发现多个microRNA在胃癌组织中异常表达,包括 miR-30a。 miR-30a属于 miR-30家族,其他成员还包括 miR-30b、 miR-30c、 miR-30d、 miR-30e,目前 miR-30家族在结肠癌,肺癌,肾细胞癌等多种肿瘤中已有报道,但它们在肿瘤中发挥的作用不尽相同[8-10]。虽然多数肿瘤研究中 miR-30a表达下调,但在其胃癌中的表达水平及作用机制还有待阐明。尤其是 miR-30a在调控胃癌发展过程中其关键靶基因的鉴定。因此,本研究针对 miR-30a在胃癌中的作用及其机制进行了初步的研究探讨。目的明确 miR-30a在人胃癌组织以及癌旁正常胃粘膜组织中的表达情况,预测和鉴定 miR-30a新的靶基因,阐明 miR-30a在胃癌发展进程中可能通过对靶基因的调控影响肿瘤细胞生长、转移,以及 miR-30a可能作为新的胃癌诊断标志物和治疗靶点。方法1.分析 miR-30a在胃癌中的表达情况以及其表达水平与临床特征相关性Trizol法提取病人胃癌组织及其癌旁组织样本中的总RNA,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)相对定量方法检测 miR-30a的表达水平。结合相应临床资料,分析 miR-30a表达水平的高低与胃癌患者的年龄、TNM分期以及淋巴结转移有无相关性。统计分析TCGA数据库中 miR-30a在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况。2.检测 miR-30a对胃癌细胞增殖、转移能力的影响在SGC-7901和BGC-823两株胃癌细胞株中转染 miR-30amimic或 miR-30ainhibitor对其进行过表达或抑制其表达,检测其对肿瘤细胞增殖、转移能力的影响。在SGC-7901细胞中转染 miR-30aagomir,检测其肿瘤细胞腹腔播散转移的情况。3.鉴定 miR-30a在胃癌中新的靶基因及其功能利用Target Scan数据库预测 miR-30a的靶基因,结合文献调研在组织样本中对候选靶基因FAPα、PDGFRB和WISP1进行初筛。构建含有 miR-30a结合位点的FAPα3’UTR片段,连接荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告基因活性实验鉴定FAPα为 miR-30a的靶基因。统计分析TCGA数据库中胃癌组织中FAPα的表达情况。在SGC-7901细胞中转染 miR-30a mimic,通过q RT-PCR和Western blot对FAPα的表达水平进行检测。在BGC-823和SGC-7901细胞中转染含有FAPαCDS区域的质粒,检测其对胃癌细胞增殖、转移的影响。将过表达FAPα质粒与 miR-30a mimic共转染SGC-7901细胞,验证 miR-30a对FAPα的功能调节。结果1. miR-30a在29例人胃癌组织样本中的表达水平显著低于之配对的癌旁正常组织(P<0.05)。 miR-30a表达水平的高低与胃癌患者的TNM分期有统计学差异(P<0.05),而与患者的年龄以及淋巴结转移情况的无统计学差异。对TCGA数据库中胃癌组织样本分析发现, miR-30a胃癌组织样本中的表达显著低与癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05)。2.在SGC-7901和BGC-823过表达 miR-30a后,SGC-7901和BGC-823细胞的增殖能力和转移能力受到明显抑制(P<0.05)。而在抑制了 miR-30a的表达后,两株细胞的增殖能力和转移能力相对于NC组有了显著增强(P<0.05)。在腹腔播散实验中,过表达 miR-30a明显抑制了肿瘤细胞的播散转移(P<0.05)。3.Target Scan数据库预测FAPα、PDGFRB和WISP1为 miR-30a的靶基因,经过对29例配对组织样本进行q RT-PCR验证分析,PDGFRB和WISP1的表达量在胃癌组织及其相应的癌旁正常胃黏膜组织中无明显差异,只有FAPα在胃癌组织样本中表达水平显著高于癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05)。通过双荧光素酶实验鉴定FAPα是 miR-30a的靶基因。在SGC-7901中过表达FAPα后,FAPα的m RNA表达水平和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。FAPα在TCGA数据库中胃癌组织样本中显著高表达(P<0.05)。过表达FAPα可显著增强SGC-7901和BGC-823的增殖、转移能力(P<0.05)。在SGC-7901细胞中过表达FAPα和 miR-30a后,该组细胞增殖、转移能力较过表达 miR-30a组显著增强(P<0.05)。结论1. miR-30a在胃癌中低表达,其表达水平与患者TNM分期有关,提示 miR-30a可能参与胃癌的发生及发展进程。2. miR-30a具有抑制胃癌细胞转移、增殖的作用,提示 miR-30a可作为胃癌的治疗靶点。3.FAPα为 miR-30a的靶基因,其具有促进胃癌细胞增殖、转移的作用,提示 miR-30a在胃癌中可通过对FAPα的调控抑制胃癌细胞的增殖、转移。