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PGC7(也称为Stella或Dppa3)首先被鉴定为在原始生殖细胞(PGCs)中高度表达的基因,还是一个参与早期胚胎发育过程中印记维持的母源效应蛋白。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,DNA甲基转移酶(DNMTs)的活性对其至关重要。MEK/ERK信号通路响应多种细胞外信号并将其转化成各种特定的生物反应,还能够调控DNMT1/DNMT3a的活性。RACK1是一种支架蛋白,与不同的细胞蛋白相互作用,是各种途径的关键介质,并有助于多种类型的细胞功能。已有文献报道从PGC7和TET3或DNMT3a蛋白之间的相互拮抗角度来揭示其印记维持机理,但PGC7是否存在翻译后调控机制调控DNMT1/DNMT3a功能还有待研究。为此,本研究采用免疫共沉淀(CO-IP)、免疫印迹(Western Blot)、免疫染色、甲基化染色等方法,揭示了PGC7对ERK磷酸化的调控机制,并进一步研究了PGC7介导的ERK磷酸化对DNMT1/DNMT3a功能的影响,以及ERK的活性对整体DNA甲基化水平的影响和ERK对DNMT1S717的磷酸化对整体DNA甲基化水平的影响。研究结果如下:1.研究发现,细胞内敲降PGC7会下调ERK的磷酸化,但PGC7与ERK不存在互作。蛋白质免疫共沉淀和western blot进一步发现,RACK1与PGC7,MEK1,ERK1,ERK2均存在互作关系,且RACK1会减弱MEK1和ERK1的相互作用,PGC7会减弱RACK1和ERK1/2的相互作用。表明PGC7可优先结合RACK1而间接地促进MEK与ERK的结合。而且,敲降RACK1会促进ERK的磷酸化。因此,PGC7调节ERK磷酸化的机制之一是通过RACK1来发挥作用的。2.ERK能够调控DNMT1/DNMT3a的定位和稳定性。免疫染色结果表明,MEK的抑制剂U0126处理能促进DNMT1的核定位和DNMT3a的胞质定位。并进一步被PD处理后细胞核质分离的Western blot结果所证实,同时也表明PD处理导致的DNMT1入核不是由UHRF1介导的。ERK的特异性抑制剂SCH和真核生物蛋白质合成的抑制剂CHX处理后,还发现抑制ERK的活性能提高DNMT3a蛋白的稳定性。3.ERK1和DNMT1,ERK1和DNMT3a都存在相互作用和细胞质与细胞核的共定位。本研究通过GPS3.0软件预测发现DNMT1/DNMT3a上存在多个ERK修饰位点,结合磷酸化质谱数据中已鉴定存在的磷酸化修饰位点,选取了几个打分值高的磷酸化修饰位点。分别构建了p3×Flag-DNMT1S15A,DNMT1S717A,DNMT1S958A和DNMT1S1421A真核表达载体,p3×Flag-DNMT3a S102A,DNMT3a S251A,DNMT3a T257A和DNMT3a S251T257AA真核表达载体。免疫荧光发现DNMT1S717A蛋白的细胞内定位发生了入核的变化,与抑制ERK活性的效果一致。表明ERK能磷酸化DNMT1S717而影响其细胞内定位。而位点突变的DNMT3a蛋白的细胞内定位则无显著变化。4.本研究还发现敲降PGC7会导致DNMT1核输入和DNMT3a核输出增加。表明PGC7可通过下调ERK磷酸化而调控DNMT1/DNMT3a的细胞内定位。甲基化染色发现,U0126处理显著上调了整体DNA甲基化水平。DNMT1S717A提高了整体DNA甲基化水平。表明ERK对DNMT1S717的磷酸化会影响整体DNA甲基化水平。综上所述,本研究发现PGC7能维持ERK的磷酸化,并从蛋白互作的角度揭示了其维持机制,还发现PGC7介导的ERK磷酸化会影响DNMT1/DNMT3a功能,抑制ERK的活性会升高整体DNA甲基化水平以及ERK对DNMT1S717的磷酸化会影响整体DNA甲基化水平。证实了PGC7通过维持ERK通路活性调控DNMT1/DNMT3a功能。进一步拓展了PGC7在印记维持方面的作用和机理。