第一部分亚慢性铝暴露对大鼠神经行为影响及其机制研究铝(aluminum, Al)是地壳中第三大化学元素,也是含量最多的金属元素,铝及其化合物在日常生活、生产中应用广泛,可通过饮水、食物、药物、烹调用具及粉尘等多种途径进入人体。铝是公认的强神经毒素,也是引起阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等多种神经退行性疾病的重要环境危险因素之一。铝在AD发生中的作用仍有争议,可能与实验用含铝化合物的种类及其在生理pH值条件下的化学形态有关。麦芽酚铝[aluminum-maltolate, Al(mal)3]是一种呈电中性的含铝复合物,在pH=7时能形成亚稳溶液,有利于进行铝神经毒性的相关研究。行为学改变是铝神经毒性的早期监测指标;海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)足一个公认的与学习记忆有关的电生理模型；铝的过量接触和蓄积可损害学习记忆功能,导致老年痴呆样病症；神经系统病理改变是铝致认知功能损害的基础。本部分内容采用亚慢性腹腔注射Al(mal)3染毒SD大鼠建立神经系统损伤模型,从神经行为学、电生理、组织病理学及体内铝蓄积探讨铝的神经毒性。第一章亚慢性铝暴露对大鼠神经行为的影响目的：探讨Al(mal)3对大鼠神经系统的毒性作用。方法：采用Morris水迷宫(Morris water maze. MWM)、旷场实验(open field test. OFT)对2月龄健康雄性SD大鼠进行行：为学筛查,取学习记忆能力在5%-95%范围内的大鼠40只作为研究对象,按体重随机分为4组：生理盐水组、10μM/kg、20μM/kg、40μM/kg Al(mal)3染毒组。采用亚慢性腹腔注射Al(mal)3进行染毒,0.2ml/d,共60d。采用MWM、跳台实验(step-down test, SDT)、避暗实验(step-through test, STT)测定大鼠学习记忆能力；采用OFT测定大鼠自主活动能力。结果：亚慢性腹腔注射Al(mal)3染毒可导致大鼠MWM定位航行实验潜伏期相对延长,但差异无统计学意义(P>0.05);空间探索实验中,与生理盐水组比较,20μM/kg.40μM/kg Al(mal)3染毒组找到平台时间明显延长(P<0.05)；各Al(mal)3染毒组穿越原平台位置次数明显减少(P<0.05)。相关分析显示,铝暴露剂量与找到平台时间(rs=0.664,P<0.05),穿越平台位置次数(rs=-0.641,P<0.05)之间存在明显相关关系。SDT实验发现,Al(mal)3染毒组潜伏期明显缩短^,错误次数1和2明显增加,除低剂量Al(mal)3染毒组错误次数2外,其他各染毒组上述三指标与生理盐水组比较,均具有统计学意义(P<0.05)。染毒组大鼠STT潜伏期逐渐缩短,错误次数1和2逐渐增加,与生理盐水组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析显示,铝暴露剂量与学习成绩(rs=0.789,P<0.01),潜伏期(rs=-0.708,P<0.01),记忆成绩(rs=0.466,P<0.05)之间存在明显相关关系。在OFT中,随染毒剂量的升高,各染毒组大鼠中央格停留时间明显延长,竖起次数、跨格次数明显减少,除低剂量染毒组竖起次数外,其余各染毒组上述观察指标与生理盐水组相比,均有统计学意义(P<0.05)。结论：亚慢性Al(mal)3染毒对大鼠神经系统具有明显损伤作用。第二章亚慢性铝暴露对大鼠LTP的影响目的：探讨亚慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠海马LTP的影响。方法：神经行为测试后,从每组随机取4只大鼠,采用电生理学方法进行海马LTP的测定。结果：与生理盐水组相比,Al(mal)3染毒组大鼠海马LTP受到明显抑制(P<0.05)。除10μM/kg Al(mal)3组在高频刺激后10min外,各Al(mal)3染毒组在高频刺激(high-frequency stimuli, HFS)后其余各时点与生理盐水组相比,标化的群体兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)的振幅明显降低(P<0.05)。结论：Al(mal)3可抑制大鼠海马CAl区LTP。第三章亚慢性铝暴露对大鼠海马形态结构的影响目的：探讨亚慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠海马形态结构的影响。方法：采用HE染色、普通光镜观察海马的大体结构,采用透射电镜观察海马的超微结构。结果：光镜观察发现,生理盐水组海马区神经细胞排列整齐,随着染铝剂的增高,细胞排列逐渐变凌乱,高剂量组可见细胞连接松懈,细胞核固缩,细胞周围出现环状带。电镜下可见生理盐水组细胞核形态规则,染色质分布匀匀,线粒体形态规则,嵴排列整齐,而随着染铝剂量的增高,细胞核皱缩,染色质边聚,核膜破裂,线粒体逐渐出现肿胀,破裂并可伴有线粒体嵴减少或消失。结论：亚慢性Al(mal)3染毒可导故大鼠海马结构严重受损。第四章亚慢性铝暴露对大鼠血铝、脑铝含量的影响目的：探讨亚慢慢性腹腔注射Al(mal)3对大鼠脑铝、血铝含量的影响。方法：动物分组及染毒同第一章,LTP测试结束后,采用石墨炉原子吸收分光光度法(graphite furnace atomic absorption spectrometry)测定大脑皮质、血清中铝含量。结果：脑铝含量均随染毒剂量的升高而增高,与生理盐水组比较有统计学差异(P<0.05)。结论：亚慢性Al(mal)3染毒可导致大鼠体内铝蓄积。第二部分铝暴露对淀粉样蛋白生成的影响AD是以进行性记忆减退、认和障碍和人格改变为主要临床表现的神经退行性疾病,老年斑(senile plaques, SPs)、神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles. NFTs)和神经元丢失是其特征性病理表现。β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)是构成SPs的主要成分,也是NFTs及血.管淀粉样变性的生化基础。Ap是种由40-43个氨基酸所构成的难溶性蛋白质,由淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor. APP)经淀粉样裂解途径所产生。Aβ的过度产生和蓄积可能是各种原因诱发AD的共同途径,是AD形成和发展的关键因素。长期摄入美国居民日常膳食规定铝量可导致大鼠海马和大脑皮层的APP过度表达,引起Aβ级联反应;大鼠神经元细胞暴露于亚致死浓度的三氯化铝(50μM)3周以上,可出现Aβ免疫阳性沉淀；铝可促进Aβ由α-螺旋向β-片层结构转变,加速Aβ生成和聚集,增加Aβ低聚物的稳定性。有研究认为铝可能通过直接影响Aβ合成代谢而导致实验动物脑内Aβ含量增加,但其确切机制目前尚不清楚。解聚素和金属蛋白酶-10(Adisintegrin and metalloproteinase-10, ADAM10)是最主要的α-分泌酶。APP的β-位点裂解酶1(β-site AβPP cleaving enzyme, BACE1)被认为是脑中涉及到Aβ产生的主要β-分泌酶。早老素1(presenilin1,PS1)是γ-分泌酶的重要催化成份。γ-分泌酶对APP的裂解能够产生Aβ40和Aβ42。Aβ42更易水解和形成原纤维,是AD老年斑的主要成份。本部分将采用动物实验、体外实验,分别对APP淀粉样物质代谢途径和非淀粉样物质代谢途径中的APP、ADAM10/17/9、BACE1和PSl的基因、蛋白表达,BACE1活性及Aβ40和Aβ42含量进行测定,探讨铝对APP代谢的影响。第一章亚慢性铝暴露对大鼠淀粉样蛋白生成的影响目的：探讨Al(mal)3对大鼠APP分解代谢的影响。方法：动物分组及染毒同第一部分,分别采用ELISA、qRT-PCR测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1和PSI的基因、蛋自表达,采用ELISA法测定BACE1酶活性及Aβ40和Aβ42含量进行测定。结果：随Al(mal)3暴露剂量的升高,大鼠皮质APP蛋白、基因表达逐渐增加,高剂量组APP蛋白、基因表达与生理盐水组比较,具有统计学差异(P<0.05)。高剂量Al(mal)3染毒组ADAM10、ADAM17和ADAM9的蛋白和基因表达较生理盐水组明显降低,差异具有统计学意意义(P<0.05)。中、高剂量Al(mal)3染毒组BACEl基因表达和蛋白含量与生理盐水组比较,均具有统计学差异(P<0.05)。中、高剂量。Al(mal)3染毒组BACEl酶活性与生理盐水组比较明显升高,具有统计学意义(P<0.05)。PSI蛋白表达随Al(mal)3染毒剂量的升高而逐渐增加,各Al(mal)3染毒组PSI蛋白含量与生理盐水组比较均具有统计学意义(P<0.05)。随染毒剂量的升高,Aβ40含量逐渐降低而Aβ42含量逐渐升高,中、高剂量Al(mal)3染毒组Aβ40含量与生理盐水组比较具有统计学差异(P<0.05)。低、中、高剂量Al(mal)3染毒组Aβ42含量与生理盐水组比较具有统计学意义(P<0.05),结论：铝可通过增强APP的淀粉样水解,抑制其非淀粉样水解而导致Aβ42生成增多。第二章铝暴露对PCl2细胞淀粉样蛋白生成的影响目的：控讨Al(mal)3染毒对PCl2细胞APP分解代谢的影响。方法：PC12细胞在Al(mal)3终浓度为0,50,100,200,400pM的培养基中培养12h,24h,48h后,采用ELISA法测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1、PS1、Aβ40和Aβ42蛋白含量,采用qRT-PCR测定APP、ADAM10、ADAM17、ADAM9、BACE1、PS1基因表达,采用ELISA法测定BACE1酶活性。结果：400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,其APP蛋白、基因表达明显增加,与对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。50,100,200,400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,ADAM10蛋白和基因表达均显著下降,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。50,100,200,400μM Al(mal)3染毒PC12细胞24h,48h后,ADAM17和ADAM9蛋白和基因表达均显著下降,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Al(mal)3染毒可导致PC12细胞BACE1蛋白、基因表达增加。400μM A1(mal)3染毒PC12细胞12h,24h,48h后,其BACE1蛋白和基因表达与对照组比较明显增加(P<0.05)。随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,PC12细胞Aβ40表达逐渐减少而Aβ42表达逐渐增加。结论：体外实验证实,Al(mal)3对APP的淀粉样水解具有明显促进作用,同时对分淀粉样水解具有明显抑制作用。第三部分铝暴露对Reelin信号转导通路的影响脑中Aβ的过度表达是导致AD发病的主要因素。Aβ是由APP经β-,γ-分泌酶连续水解所形成。一些研究认为,APP和β-分泌酶均存在与细胞表面,被内吞进入内涵体后产生大量Aβ,相关分子机制尚不清楚。Reelin是一种大型的细胞外糖蛋白,Reelin可与细胞膜表面受体ApoER2和VLDLR受体结合,通过胞内衔接蛋白Dab1将Reelin信号转导入细胞内。Reelin信号可引起Dab1依赖的涉及多种激酶的信号级联反应。在神经系统发育期间,可以调节神经元的正确迁移和定位。而且,Reelin信号通路被认为参与了神经退行性疾病的发生。近年来,越来越多的证据表明,Reelin及其信号通路的组分与AD特征病理表现相关。AD转基因小鼠动物模型研究发现Reelin存在于老年斑中。Dab1可增加转染细胞和原代培养细胞膜表面APP农达,增加APP被α-分泌酶裂解,减少Aβ生成。Reelin可影响Dab1的这种作用。Reelin能够显著增加Dab1和APP的免疫共沉淀,而且,Reelin可减少Aβ产生。因此,Reelin及其信号转导通路成分可能参与了APP的运输及裂解过程。但确切制目前尚不清楚。本部分采用体内和体外实验,探讨Al(mal)3致APP代谢异常过程中Reelin信号转导通路相关成分的表达变化。第一章亚慢性铝暴露对大鼠Reelin信号转导通路相关成分蛋白、基因表达的影响目的：探讨铝暴露对大鼠皮质Reelin及其信号转导通路相关基因表达的影响。方法：动物分组及染毒同第一章,采用ELISA法测定大鼠大脑皮质Reelin、ApoER2、VLDLR、 Dab1蛋白含量,采用qRT-PCR测定大鼠大脑皮质Reelin基因(RELN).ApoER2、VLDLR、 Dab1基因表达。结果：随染毒剂量升高,Reelin蛋白及基因表达逐渐下降,各剂量Al(mal)3染毒组大鼠皮质Reelin蛋白含量及RELN基因表达与对照组比较均具有统计学差异(P<0.05)。中、高剂量Al(mal)3染毒组VLDLR基因农达较对照组明显升高而蛋白含量却显著下降,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。各Al(mal)3染毒组大鼠皮质ApoER2基因表达较对照组显著下降(P<0.05),高剂量Al(mal)3染毒组大鼠皮质ApoER2蛋白含量较对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。各染毒组Dab1基因表达与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),中、高剂量组Dab1蛋白含量较对照组明显降低(P<0.05)。结论：亚慢性铝暴露可影响大鼠皮质Reelin信号转导通路相关成分的基因和蛋白表达,铝致Aβ合成异常可能与此有关。第二章铝暴露对PC12细胞Reelin信号转导通路相关成分蛋白、基因表达的影响目的：探讨铝暴露对PC12细胞Reelin及其信号转导通路相关基因、蛋白表达的影响。方法：细胞染毒同第二部分,采用ELISA法测定PC12细胞Reelin、ApoER2、VLDLR、 Dab1蛋白含量,采用qRT-PCR测定PC12细胞RELN、ApoER2、VLDLR、Dab1基因表达。结果：Reelin蛋白和基因表达随染毒剂量升高而逐渐减少,200、400μM Al(mal)3染毒PC12细胞12h,24h和48h,Reelin蛋白和基因表达较对照组明显降低(P<0.05)。200、400μMAI(mal)3染毒组VLDLR蛋白和基因表达较对照组明显下降(P<0.05)。除50μMAl(mal)3染毒PC12细胞24h外,其余各染毒组PC12细胞染毒12h,24h和48h均可导致ApoER2蛋白和基因表达明显下降(P<0.05)。各剂量AI(mal)3染毒PC12细胞24h和48h均可导致Dab1蛋白和基因表达显著下降,与对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。结论：铝暴露可影响PC12细胞Reelin信号转导通路相关成分的蛋白和基囚的表达。结论：1.铝致Aβ生成增多在铝致学习记忆障碍和AD等神经退行性疾病发生过程中起十分重要的作用。铝致Aβ生成增多的主要机制为：促进BACE1和PSI表达,增加BACE1活性,使APP水解以淀粉样物质途径为主,同时降低ADAM10/17/9表达,进一步减少APP的非淀粉样水解途径：2. Reelin信号转导通路可能参与了铝致APP水解异常、Aβ生成增多过程的调节。