柑橘是我国南方和世界第一大水果。在采后贮藏、运输和销售环节,我国柑橘每年因真菌病害造成的损失非常巨大,其中最主要的真菌病害是由意大利青霉(Penicillium italicum Wehmer)和指状青霉(Penicillium digitatum Sacc)引起的柑橘青、绿霉(Blue and Green Mould)。目前柑橘最为主要的防腐保鲜手段是化学药剂,然而化学药剂的残留量、病原菌的抗药性、环境污染及其对人体健康的影响迫使我们去寻找一种可行的替代手段。本课题以从土壤中分离出来对柑橘采后青、绿霉具有很好防治效果的生防菌柠檬形克勒克酵母34-9(Kloeckera apiculata 34-9, KA)为实验材料,从该菌的抗菌物质、诱导柑橘果实抗性、直接对病原菌寄生、营养与空间竞争等四个方面机理进行研究。主要结果如下：1.KA分泌抗菌物质。通过硫酸铵沉淀、有机溶剂萃取及发酵液直接超低温干燥等手段,实验发现乙醚萃取可以得到稳定的抗菌物质。利用薄层层析色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)等分离纯化与鉴定方法,结果表明该抗菌物质为苯乙醇(2-Phenylethanol, PEA)。"In vitro", PEA稀释750倍(0.13%)即可很好的抑制柑橘青、绿霉在PDB中生长；"In vivo", PEA可以明显改善纽荷尔脐橙(Citrus sinensis Osbeck cv. Newhall)贮藏性能,防腐效果与咪酰胺(PCZ)相当且对果实的维生素C、可溶性固形物和可滴定酸等品质没有影响。针对PEA的抗菌机理,我们使用数字表达谱升级版测序的方法进行了研究。对所有|log2Ratio|≥1的1933和1909条差异表达基因进行分析,揭示PEA抗菌机理涉及如下几点：(1)抑制病菌青霉DNA复制与修复；(2)抑制RNA转率与翻译；(3)抑制氨基酸、氨基酸-tRNA等合成；(4)抑制细胞周期循环；(5)促进蛋白和酶类代谢与降解；(6)诱导过氧化氢酶体和吞噬小体的形成,最终促使细胞程序性死亡。2.KA诱导柑橘果实产生抗性。通过对抗性相关酶、H2O2等测定,发现KA在早期可以明显诱导H2O2大量产生,随后柑橘果皮SOD、POD、CAT、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等抗性酶活性也明显上升,此外粗提取物和PEA处理也可以得到类似的结果。说明KA可能通过诱导大量产生H2O2来诱导柑橘产生抗性,而抗性的诱导则是通过分泌PEA来实现。柑橘基因芯片(Genechip)的结果验证了上述结论,结果显示KA可以诱导乙烯(ET)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蜡质合成、抗氧化及苯丙烷代谢等相关基因(如木质素)上调表达,细胞壁半纤维素及脂类降解等有关的基因下调表达。KA诱导的803个差异基因中有57.4%的基因在粗提取物或PEA中有相同的响应,这还是在粗提取物中只有339个基因差异表达情况下的结果(这和处理时使用的浓度有关)。上述结果表明：(1)KA作为一种生物胁迫可以刺激柑橘果皮产生抗性,而这种刺激作用部分是通过分泌PEA等物质作为介导来实现；(2)KA通过快速诱导柑橘SOD酶活性的提高及H202的大量产生,H202再作为初级信号分子诱导JA/ET介导的信号防卫途径,最终刺激柑橘PR蛋白、木质素等抗性相关的代谢途径及果实蜡质等基因表达,从而抑制青、绿霉侵染。3.KA直接寄生青霉菌丝并与青霉发生空间竞争。通过絮凝率测定,发现KA在豆芽汁葡萄糖培养基(BSM)中培养48 h后其絮凝率达79.2%。利用扫描电子显微镜(SEM)技术,结果发现：一方面KA可以通过分泌“凝集素”吸附到病原菌丝表面；另一方面在果实表面和伤口处,KA通过分泌胞外聚合物(EPS)将其自身细胞与周围细胞聚合在一起形成一种没有规则的但很致密的酵母层(Biofilm),给果实穿上一层厚厚的盔甲外罩,阻止孢子或菌丝与伤口处营养物质接触,从而抑制孢子萌发和菌丝生长。4.KA不涉及碳、氮源营养竞争。通过对KA及柑橘青、绿霉的碳、氮源分析,结果显示KA对碳源要求比较严格,只能利用葡萄糖、果糖和纤维二糖,对于蔗糖、乳糖、半乳糖以及麦芽糖等不能利用,而青、绿霉可以利用所试验的蔗糖、乳糖、半乳糖等大部分碳源；对于氮源无论是KA还是青、绿霉都可以使用包括硫酸铵在内的大多氮源。在柑橘果实中,以果糖、葡萄糖和蔗糖为主的可溶性糖(主要碳源)和以游离氨基酸、多肽及蛋白质等为主的有机氮源含量丰富,因此可以推断KA不与病菌营养碳、氮源,但有可能竞争维生素或微量元素。综上所述,KA主要作用机理涉及分泌抗菌物质、诱导柑橘抗性、空间竞争及直接的吸附寄生。