研究背景及研究意义鳞翅目(Lepidoptera)昆虫为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二个大目,分布范围极广,多数为农林业经济作物害虫,如菜青虫、小菜蛾以及棉铃虫(Helicoverpa armigera)等。双链DNA杆状病毒(baculovirus),属于杆状病毒科(Baculovirvidae),是鳞翅目昆虫的天然病原体,由于对脊椎动物安全无污染,用于害虫的生物控制显示出很好的应用前景。病毒感染昆虫宿主后双方相互调节,相互作用,阐明昆虫宿主细胞抵抗杆状病毒感染的分子机制,不仅可以丰富无脊椎动物抗病毒机理知识,而且可以为研究设计新的害虫生物控制方案提供理论依据。国内外研究进展及存在的科学问题研究表明,细胞凋亡(apoptosis)是宿主抵抗杆状病毒感染的重要机制之一。细胞凋亡及调控研究在脊椎动物中已取得较深入、系统的研究成果,但关于无脊椎动物尤其是鳞翅目昆虫细胞凋亡的调控研究相对少。p53是参与人类细胞凋亡内源途径的重要分子；无脊椎模式生物果蝇(双翅目)中,p53突变或缺失会抑制多种因素诱导的细胞凋亡,如离子辐射,病毒感染等。然而草地贪夜蛾(鳞翅目)的p53被干扰后紫外照射或喜树碱仍可诱导正常的细胞凋亡。昆虫之间存在的巨大差异,使得研究其它昆虫细胞凋亡的调控显得很有必要。另一方面,在哺乳类和果蝇中,p53具有调节细胞周期阻滞和修复DNA损伤的功能,参与调节机体DNA损伤反应,具有促细胞存活作用,而关于鳞翅目昆虫棉铃虫p53有怎样的凋亡调控和抗病毒作用还不清楚。研究结果论文运用基因克隆,RT-PCR, Q-PCR, western blot,基因过表达,RNAi,MTT细胞存活实验,病毒绝对定量等实验方法,研究了棉铃虫p53基因在杆状病毒感染宿主细胞过程中的抗病毒功能,取得如下结果：1、用棉铃虫体外表皮细胞系HaEpi被苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)感染发生凋亡的细胞模型,检测了细胞凋亡调控基因caspase-1和caspase-5的表达模式,结果显示,caspase-1和caspase-5在总趋势上上调表达。2、克隆得到棉铃虫p53基因ORF序列,序列分析发现P53蛋白在不同物种中变异较大。系统进化树分析发现棉铃虫P53与鳞翅目其它昆虫P53的进化关系最近。3、制备了棉铃虫P53抗体,检测了体内表皮、中肠、脂肪体组织中的P53表达模式,发现P53在棉铃虫表皮组织中表达丰富。4、在棉铃虫体外表皮细胞系中单独过表达p53,表达产物定位于细胞核内并具有促细胞凋亡活性,表明棉铃虫p53具有促凋亡作用。5、为了确定p53是否在AcMNPV感染诱导的表皮细胞凋亡中起调控功能,我们通过干扰沉默棉铃虫表皮细胞中p53的表达,然后用AcMNPV感染细胞,结果细胞凋亡率没有受到影响。6、为了进一步研究棉铃虫p53是否具有抗病毒功能,我们首先在HaEpi细胞中过表达p53,然后同时感染AcMNPV48h和72h,提取总病毒DNA,结果表明,HaEpi细胞中过表达p53显著降低了AcMNPV DNA在HaEpi细胞内的复制。7、为了进一步研究过表达p53对AcMNPV复制的抑制是否是因为过表达p53引发细胞凋亡,导致细胞数量减少引起的,我们将HaEpi细胞中过表达p53后,然后感染AcMNPV病毒48h,用MTT方法检测细胞的存活率,结果表明,过表达的p53在病毒感染时能显著促进细胞的存活。结论及意义1.体外研究表明：棉铃虫p53基因产物定位于细胞核,具有促凋亡作用。2.在病毒AcMNPV感染的棉铃虫表皮细胞系中p53在凋亡调控中没有关键调控作用,但具有明显的抑制病毒复制,促进细胞存活的功能。本论文丰富了无脊椎动物中关于宿主和病毒相互作用的研究,为研究害虫生物控制新方案提供资料。