单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV),是一种常见的病原体,是第一个被发现的人类疱疹病毒,它容易建立潜伏感染并且潜伏的病毒可以在以后间歇性地复发引起疾病。HSV分为HSV-1和HSV-2两型。其中HSV-1主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等,HSV-2主要引起的疾病是生殖器疱疹,并常伴有尿道炎、膀胱炎或宫颈炎等,所有年龄段都能感染。作为细胞内寄生病毒,HSV可在人体神经节建立终生潜伏期并可消除宿主的免疫应答,这些都是宿主难以有效清除HSV感染的重要因素。尽管现有的抗病毒药物如阿昔洛韦等能够选择性地抑制其复制、缩短其感染过程,但却不能从根本上控制病毒的潜伏、限制疾病的传播以及复发。因此,研制安全有效的HSV疫苗,诱导机体产生较强的体液免疫反应和特异性细胞免疫反应,是预防该病毒的理想方法。HSV-2编码至少有12个糖蛋白,其中gD (glycoprotein, gD), gB, gC是在感染细胞中表达最丰富的糖蛋白,也是HSV-2病毒包膜上的主要糖蛋白。在这些糖蛋白中,具有重要抗原表位的gD与细胞表面受体相互作用,在病毒吸附和进入细胞中发挥重要作用,也是宿主针对HSV感染产生体液免疫反应和细胞免疫反应的主要靶标。因此,糖蛋白gD是理想的HSV疫苗候选抗原。本研究通过对HSV-2gD抗原表位分析,筛选HSV-2gD胞外区片段抗原表位富集区,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,优化设计基因序列,化学合成了全新的HSV-2gD基因序列。将合成的基因片段插入真核表达载体pMD902内,构建重组表达质粒pMD902-gD。将重组表达质粒电转染至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO cell)DG44细胞,Western blot检测培养细胞上清目的蛋白的表达。然后把阳性细胞稀释后放入96孔板,通过培养基去HT(次黄嘌呤,胸腺嘧啶核苷),逐渐增加培养基MTX(甲氨碟呤)浓度筛选高表达gD糖蛋白的细胞株,Dot blot和SDS-PAGE检测筛选细胞目的蛋白的表达。筛选的稳定高表达细胞株,用1升无血清培养基悬浮培养,培养细胞上清用离子交换层析,凝胶过滤层析方法纯化。高效液相色谱(HPLC)法测定纯化蛋白的纯度,Bradford法测定纯化蛋白浓度。ELISA法检测纯化的重组蛋白抗原性。用重组gD蛋白免疫小鼠,ELISA法测血清特异性抗体效价和免疫小鼠脾细胞细胞因子的表达。实验结果显示,转染重组蛋白的培养细胞上清经Western blot分析,在分子量约为44kDa处可见单一目的蛋白条带,说明重组糖蛋白gD在DG44细胞中以可溶形式表达,糖基化均一。通过将阳性细胞用含有MTX的培养基加压筛选以及细胞株的稳定性检测得到8株稳定高表达gD糖蛋白细胞株。无血清悬浮培养高表达细胞株,纯化获得重组蛋白纯度超过95%, SDS-PAGE及Western blot检测均显示单一蛋白条带,浓度约为1.9mg/mL,1L细胞培养液共获得蛋白总量57mg。ELISA检测显示重组糖蛋白具有较好的抗原性和特异性。间接ELISA检测免疫小鼠抗血清抗体效价均≥1：5000。纯化的重组gD糖蛋白免疫小鼠可以刺激小鼠脾细胞表达细胞因子IL-2和IFN-γ,表明获得的重组糖蛋白gD有良好的免疫原性。实验成功建立了稳定高表达重组gD糖蛋白的无血清悬浮培养细胞系,并证实重组gD蛋白具有良好的免疫活性,为HSV-2基因重组亚单位疫苗研制奠定了基础。