8-叔丁胺基甲基橙皮素(MTBH)对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的保护作用及其在大鼠体内药物代谢动力学研究

来源 :安徽医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:yangbao_2002
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肝纤维化(liver fibrosis)是多种慢性肝脏疾病、病毒、药物、代谢及酒精等多种原因引起的慢性肝损伤愈合反应,其主要特征是肝功能损害和肝内细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)大量过度沉积。研究表明,过度沉积的ECM主要来源于活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC),而HSC的增殖活化则是肝纤维化发生发展过程中的中心环节,通过抑制HSC的活化和增殖可以有效减缓肝纤维化的发生发展过程并可治疗肝纤维化。四氯化碳(CCl4)是常用的肝毒素,是诱导实验动物肝损伤包括肝纤维化最常用试剂。大量研究表明传统中药在肝纤维化的预防和治疗中起着重要作用,目前已取得许多研究进展。橙皮苷(Hesperitin)是一类天然黄酮类化合物,富含于芸香科柑橘属果实的果皮中,橙皮素是橙皮苷的苷元,是其主要的药效活性成分之一。大量文献报道,橙皮素具有广泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等。但由于其水溶性差、生物利用度低、半衰期短等问题限制了其临床广泛应用。因此本实验室前期合成了一系列含有曼尼希碱新的橙皮素衍生物,同时对其抗炎活性和肝纤维化的保护作用进行筛选。结果发现橙皮素衍生物MTBH(8-亚甲基-叔丁胺基-3’,5,7-三胫基黄烷酮)能显著抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激RAW264.7细胞分泌的白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),同时对转化生长因子-β(transforming growth factor, TGF-β)诱导的HSC-T6细胞增殖活化有明显的抑制作用,表明其对肝纤维化有保护和治疗作用,提示其有进一步研究与开发的前景。为了验证这一设想,本课题进行了以下研究。1.MTBH对小鼠肝纤维化的保护作用为研究MTBH对小鼠肝纤维化的保护作用,60只ICR小鼠随机分为6组:正常组、模型组、秋水仙碱对照组(0.1 mg/kg)、MTBH低、中、高剂量治疗组(25 mg/kg、50 mg/kg、 100mg/kg)。除正常组外,其余各组均腹腔注射CCl4建立肝纤维化模型,每周2次,共持续10周,MTBH治疗组(25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg)在第6周时,每天给药1次,直至第10周结束;秋水仙碱(0.1 mg/kg)对照组在第6周时,每周给药2次,直至第10周结束。通过HE、Masson染色及免疫组化进行肝组织病理学检查,检测各组小鼠肝纤维化组织损伤程度;ALT (alanine aminotransferase,丙氨酸转氨酶)、AST (aspartic aminotransferase,门冬氨酸氨基转移酶)、ALP (alkaline phosphatase,丙氨酸转氨酶)和HA (hyaluronidase,丙氨酸转氨酶)试剂盒检测肝损伤指标ALT、AST、ALP和肝纤维化指标HA;用Western blot和Q-PCR检测α-SMA和Collagen Ⅰ在肝纤维化小鼠肝组织中的mRNA和蛋白表达水平。实验结果表明,MTBH中、高剂量组(50 mg/kg、100 mg/kg)能明显降低CCl4诱导的小鼠肝脏组织中α-SMA和Collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达,同时降低肝损伤指标ALT、AST、ALP和肝纤维化指标HA,提示MTBH对肝纤维化有一定的保护和治疗作用。2. MTBH对大鼠肝星状细胞活化和增殖的影响用MTT法检测不同浓度的MTBH (12.5、25、50、100、200、400 μM)对HSC-T6细胞的细胞活力的影响,从而判断MTBH对HSC-T6细胞的细胞毒性;用TGF-β(10ng/ml)预处理HSC-T6细胞2h后,再加低、中、高浓度的MTBH (50、100、200μM作用细胞24 h,采取MTT方法来检测MTBH对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活力影响。Western blot和Q-PCR检测HSC-T6细胞α-SMA和Collagen Ⅰ的表达水平。最终的实验结果表明,MTBH能够明显抑制HSC-T6的活化和增殖。3. MTBH在大鼠体内药代动力学和组织分布研究为研究MTBH在大鼠体内药动学特点,SD大鼠随机分为灌胃给药组(给药剂量分别为25、50、100 mg/kg)和静脉给药组(给药剂量为25 mg/kg)。给药后,按指定时间点采集血液,分离血浆并检测血浆中游离型、葡萄糖醛酸化和葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBH的药物浓度。为研究MTBH在大鼠体内组织分布特点,SD大鼠灌胃给予200 mg/kg MTBH后,不同组大鼠在指定时间点处死,肝门静脉灌流后,分离组织样本(心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑和肌肉)并匀浆,测定各组织中游离型、葡萄糖醛酸化和葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBH的浓度。MTBH在大鼠体内代谢物定性分析通过安捷伦TOF LC/MS质谱检测器结合PDA全波长紫外检测器。大鼠血浆和组织中MTBH两个主要的Ⅱ相结合代谢物分别为MTBH-O-葡萄糖醛酸化和MTBH-O-硫酸化代谢物。大鼠血浆或组织中MTBH浓度分别在水解前或用β-葡萄糖醛酸酶或硫酸酯酶(含β-葡萄糖醛酸酶,可同时水解葡萄糖醛酸化和硫酸化MTBH Ⅱ相结合代谢物)水解后用HPLC测定MTBH,通过与水解前MTBH浓度差来间接测定血浆或组织中游离型、葡萄糖醛酸化和和葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBH.结果表明,在血浆中,MTBH主要以葡萄糖醛酸化和硫酸化Ⅱ相结合代谢物存在,血浆中能测出游离型MTBH,但其体内暴露量(AUC0-t)仅为葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBHAUC0-t的0.85~1.46%,MTBH的绝对生物利用度约为31.27%。大鼠灌胃给予25.50.100 mg/kg MTBH后主要药动学参数如下,游离型MTBH的Tmax(h):0.25±0.06、0.50±0.18、0.25±0.06;t1/2(h):0.41±0.16、0.46±0.09、0.52 ±0.06;Cmax(μg/ml):0.40±0.07、0.83±0.30、1.54±0.37;AUC(μg/ml·h):0.42±0.08、 0.82±0.21、1.78±0.25。葡萄糖醛酸化MTBH的Tmax(h):1.00±0.19、1.00±0.28、1.00 ±0.19;t1/2(h):4.19±0.75、4.32±0.76、5.69±0.80;Cmax(μg/ml):4.86±1.24、8.10± 1.82、19.23±3.45;AUC(μg/ml·h):24.05±5.74、50.12±13.19、118.79±16.56。葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBH的Tmax(h):1.00±0.22、1.00±0.18、1.00±0.25;t1/2(h):4.43 ±1.05、4.68±0.64、6.20±0.64;Cmax(μg/ml):5.80±0.91、9.31±2.30、24.28±4.76; AUC(μg/ml.h):28.69±6.03、65.74±12.27、146.83±22.51。大鼠尾静脉给予25 mg/kg MTBH后主要药动学参数如下:游离型MTBH的Tmax(h):0.083±0.02 t1/2(h):0.46± 0.13;Cmax(μg/ml):11.07±2.07;AUC0-24(μg·h/ml):6.05±0.93。葡萄糖醛酸化MTBH的Tmax(h):0.50±0.02;t1/2(h):4.57±1.03;Cmax(μg/ml):13.72±2.45:AUC0-24(μg·h/ml): 80.12±9.80。葡萄糖醛酸化/硫酸化MTBH的Tmax(h):0.50±0.01;t1/2(h):4.63±1.25; Cmax(μg/ml):15.92±3.36;AUC0-24(μg·h/ml):91.75±15.42。在大鼠组织分布实验中,游离型MTBH分布于所有待测组织中,在脑和肌肉中浓度很低,然而在胃和肺中浓度较高。葡萄糖醛酸化和硫酸化MTBH是小肠、肾脏和肝脏组织中的主要形式,然而在心脏、脑和肌肉中测不到。在所有大鼠待测组织中,肝脏和小肠中MTBH(游离型和Ⅱ相结合代谢物)的浓度较高。提示MTBH在大鼠体内除小部分以游离型存在外,大部分以MTBH Ⅱ相结合代谢物形式存在,其发挥生物活性可能是游离型、葡萄糖醛酸化和硫酸化MTBH共同作用的结果。4.MTBH在体外和体内对肝脏细胞色素P450酶作用中药-药物联用潜在药物相互作用最近引起广泛关注,考虑到未来MTBH可能开发为肝纤维化保护用药,为了考察MTBH对大鼠和人CYP450代谢酶的抑制作用,探讨其与其它药物发生代谢性相互作用的可能性,并研究MTBH在体外和体内对肝脏细胞色素P450酶的作用。本实验分为体外和体内实验,体外实验:6种细胞色素P450同工酶的探针底物与大鼠或人肝微粒在加入还原型辅酶Ⅱ(NADPH)再生系统下体外孵育,同时加入不同浓度的MTBH,以不加MTBH为对照,考察MTBH对大鼠或人肝微粒细胞色素P450同工酶抑制作用。采用的探针底物分别为非那西丁(1A2)、双氯酚酸(2C9)、奥美拉唑(2C19)、右美沙芬(2D6)、氯唑沙宗(2E1)、睾酮(3A4),用LC-MS/MS法测定探针底物生成的代谢产物生成量。体内实验部分:取低、中、高剂量MTBH(25、 50.100 mg/d)预处理大鼠28后,Western blot和Q-PCR检测大鼠肝脏CYP450同工酶mRNA和蛋白表达,Cocktail(鸡尾酒)法测定CYP450同工酶活性。大鼠肝微粒体体外实验表明,MTBH对CYP3A4和CYP2E1的抑制有浓度依赖性,ICso值分别为83.66和86.55μmol·L-1,MTBH对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19的活性没有显著抑制作用。人肝微粒体体外实验结果与大鼠类似,MTBH对CYP3A4和CYP2E1的抑制有浓度依赖性,IC50值分别为93.73和88.40 μmol·L-1,MTBH对人肝微粒体CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19的活性没有显著抑制作用。大鼠体内实验表明,MTBH中、高剂量(50、100 mg/d)预处理大鼠28后,能显著降低CYP3A4和CYP2E1的mRNA和蛋白表达,MTBH高剂量(100 mg/d)能显著降低CYP2C9 mRNA表达,而对蛋白表达没有显著降低。大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性实验表明,MTBH高剂量(100 mg/kg)能显著降低大鼠肝微粒体CYP3A4和CYP2E1的活性,对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19活性没有显著作用。5.MTBH在Caco-2细胞上小肠吸收机制Caco-2细胞系来源于人结肠腺癌细胞系,当Caco-2细胞生长分化为极化细胞时,与人体小肠上皮细胞在形态学和功能上有较好的类似性,因此被广泛用于药物小肠吸收的体外细胞模型。本实验的目的是分别考察转运时间、MTBH浓度、转运液pH、实验温度、不同转运抑制剂或底物对MTBH转运影响,来研究MTBH在Caco-2细胞上转运机制。将Caco-2细胞接种于可渗透性聚碳酸脂膜上,分化融合为单层细胞膜后,在试验前后均检测跨膜电阻值(TEER)以确认细胞膜的完整性。含有不同浓度的MTBH转运液(7.5~480μM)分别加入Caco-2细胞单层细胞膜的A侧或B侧(体积分别为0.6或1.2 ml)。接收侧分别在30、60、90和120 min取样100 μL, HPLC进样分析测定转运液中MTBH浓度。结果表明MTBH(7.5~48μM)在Caco-2细胞上从A→B侧和B→A侧的转运具有浓度和时间依赖性。MTBH的吸收是H+离子驱动的AP到BL极化转运,与pH相关,而与TEER值无关。在pH梯度下(AP侧pH值为6.0,BL侧pH值为7.4),NaN3 (ATP抑制剂)或CCCP(羰基氰化物间氯苯腙,质子载体)能显著降低MTBH的转运,pH值的降低导致MTBH转运的增加可能与单羧酸转运蛋白(MCT)和缩氨酸转运体1(PepTl)有关,而PepT1的底物或抑制剂甘氨酰肌氨酸对MTBH的转运没有影响;MCT抑制剂槲皮素或根皮素,或底物类似物L-乳酸或苯甲酸均显著降低MTBH转运。采用Western blot方法发现Caco-2细胞上有MCT1、MCT3、MCT4、MCT5和MCT6的表达,通过siRNA沉默MCT1表达后,Caco-2细胞对MTBH的摄取量显著降低。MRP2抑制剂MK-571或丙磺舒能显著降低MTBH的外排,而P-gp抑制剂维拉帕米或BCRP抑制剂Ko143对MTBH的转运没有影响。综上所述,MTBH可能主要通过跨细胞被动扩散和pH依赖MCT1介导的主动转运机制。MTBH可能是MRP2外排蛋白的底物,而不是P-gp或BCRP底物。
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