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奶牛杂交改良牦牛后繁殖的后代称为犏牛,其产奶量远高于牦牛。目前,犏牛胚胎移植尚处于起步阶段,玻璃化冷冻是胚胎移植的重要技术环节,但犏牛胚胎玻璃化冷冻机制还不清楚。所以,本研究采用IVF技术生产犏牛胚胎(奶牛精子×牦牛卵子),以新鲜囊胚和经玻璃化冷冻复苏后的冻融囊胚为研究对象,提取总RNA,使用Smart-seq2方法进行扩增并构建文库进行高通量测序,通过转录组数据注释和生物信息学分析,解析犏牛胚胎冷冻的损伤机制。结果如下:(1)犏牛胚胎的体外生产(IVP)受精前无颗粒细胞(GC)残留的裸卵组(A)、保留2~3层GC的卵母细胞组(B)和完全被GC包裹的卵母细胞组(C)的囊胚率分别为13.88%、24.97%和23.26%。A囊胚率分别与B和C达到显著差异(P<0.05),但B和C差异不显著(P>0.05);牦牛卵母细胞与娟姗牛精子共同孵育12h后卵裂率和囊胚率都显著低于18h和24h(P<0.05)。(2)犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚的转录组比较分析犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚样本经深度测序后,分别得到51,099,116和54,192,358条Clean Reads,文库构建良好。将犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚Clean Reads与参考基因组进行比对,分别有39,435,615和38,621,872个Clean Reads被比对上。以|log2ratio|≥1和q<0.05设为基因差异表达的阈值,犏牛冻融囊胚相对于犏牛新鲜囊胚共筛选出11,196个差异表达基因(DEGs),其中上调表达基因有7,570个,下调表达基因有3,626个。差异基因GO功能分析主要富集于生物过程、细胞组成和分子功能3大类;KEGG注释结果表明,犏牛冻融囊胚与新鲜囊胚间,共涉及318条Pathway,其中14条Pathway显著富集。犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚可变剪切数分别有49,016和64,352个,其中转录起始区域可变剪切(TSS)和转录结束区域可变剪切(TTS)两种形式所占比例最大;SNP位点数量分别为116,681和224,750个。综上所述,本研究利用RNA-seq技术首次从转录组学角度探讨了犏牛囊胚玻璃化冷冻损伤机制,为完善胚胎的玻璃化冷冻提供新思路,同时也为进一步完善犏牛基因结构信息和胚胎玻璃化冷冻相关的新基因提供理论基础。