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研究背景:衰老是心血管疾病的独立危险因素,随着年龄增长,血管内膜稳态破坏,并导致功能障碍,这一过程在心血管疾病的发展中起着重要的作用。细胞水平的衰老,是指在氧化应激、炎症反应等损伤打击下,不可逆的细胞周期停滞,并呈现衰老相关分泌表型。研究表明,衰老过程往往伴随着自噬(autophagy)水平的下降,而促进自噬对寿命的延长有一定的获益作用。自噬过程是一个多步骤的动态过程,即自噬流,而细胞自噬的生物学功能得以行使不仅需要上游通路激活自噬,也要求自噬流的通畅。亚精胺(spermidine,SPD)是一种生物体中广泛存在的天然多胺,已有研究显示,亚精胺可以通过调控细胞自噬延长酵母、蠕虫等低等生物寿命,而给小鼠外源性补充亚精胺也能起到保护心肌,延长寿命的作用。对于亚精胺是否能影响血管内皮细胞的衰老过程,目前尚无报道。因此,我们提出假设,亚精胺可能通过促进血管内皮细胞自噬流,降低氧化应激,达到抗内皮细胞衰老的作用。研究目的:探究亚精胺能否有效抑制脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的衰老,并改善内皮细胞功能,同时探讨亚精胺的抗内皮细胞衰老作用的机制。研究方法:1.通过低浓度的LPS连续刺激HUVECs构建内皮细胞衰老模型,采用SPD干预LPS诱导的衰老内皮细胞,通过SA-β-Gal、Western Blot、实时荧光定量PCR检测衰老相关p16及p53的蛋白和mRNA表达水平,比较LPS+SPD组与LPS组内皮细胞的衰老程度。2.采用自噬流抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)处理SPD干预的衰老内皮细胞,通过SA-β-gal,Western Blot检测衰老相关p16及p53的蛋白表达水平,比较LPS组、LPS+SPD组及LPS+SPD+CQ组的HUVECs的衰老程度。同时检测各组细胞内自噬流标志蛋白LC3-Ⅱ及p62的表达水平,明确亚精胺的抗衰老作用是否通过促进自噬流实现。3.使用JC-1线粒体膜电位检测及ROS免疫荧光染色比较LPS组、LPS+SPD组、LPS+SPD+CQ组及control组线粒体膜电位及氧化应激水平,明确亚精胺是否减轻线粒体损伤降低氧化应激损伤,从而改善衰老。4.采用CCK-8实验及划痕实验检测亚精胺对衰老内皮细胞的增殖与迁移功能的影响。研究结果:1.与LPS组相比,LPS+SPD组的SA-jβ-gal染色显示蓝染细胞比例显著下降,Western Blot及荧光实时定量PCR结果发现,p16、p53的蛋白及mRNA表达量也显著降低。2.通过Western Blot检测自噬流标志蛋白LC3-Ⅱ与p62及衰老相关的p16、p53表达,结果提示亚精胺干预的LPS+SPD组较LPS组,LC3-Ⅱ及p62的蛋白表达水平均显著降低,说明亚精胺促进了自噬流的通畅。加入氯喹处理的LPS+SPD+CQ组较LPS+SPD组,p62的表达显著升高,表明细胞的自噬流被阻断,而p16及p53蛋白水平上调,提示亚精胺的抑制衰老作用被减弱。3.JC-1线粒体膜电位染色及ROS免疫荧光染色结果显示,与LPS组对比,LPS+SPD组的JC-1染色可见红色荧光/绿色荧光细胞比例显著升高,提示亚精胺干预减轻了衰老造成的线粒体损伤,ROS免疫荧光也显示ROS阳性细胞数目减少,细胞氧化应激水平降低。而LPS+SPD+CQ组与LPS+SPD组对比,JC-1染色见红色荧光/绿色荧光细胞比例显著降低,ROS免疫荧光染色见ROS阳性细胞数目显著增加,提示自噬流被阻断后,线粒体膜电位降低,氧化应激水平提高。4.CCK-8实验结果显示,各组吸光度未见统计学差异。划痕实验显示,LPS+SPD组较LPS组,细胞迁移率显著改善,而CQ+LPS+SPD组与LPS+SPD组对比,迁移率显著降低。研究结论:1.采用低浓度的脂多糖连续刺激能够构建内皮细胞衰老模型,亚精胺可改善LPS诱导的内皮细胞的衰老。2.亚精胺的抗衰老作用是通过促进自噬流通畅实现的。3.亚精胺可能通过减轻线粒体损伤,降低氧化应激水平发挥抗内皮细胞衰老的效应。4.亚精胺能有效改善LPS诱导的衰老内皮细胞的迁移功能,但对其增殖能力没有影响。