天仙子转录组测序及HnODC的鉴定与功能分析

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莨菪碱(Hyoscyamine)和东莨菪碱(Scopolamine)属于托品烷类生物碱(Tropane Alkaloids,TAs),是常用于临床的抗胆碱类药物,主要作用于副交感神经系统,具有麻醉、镇痛等作用。托品烷类生物碱来源于茄科药用植物如天仙子(Hyoscyamus niger)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura species)和铃铛子(Scopolia lurida)等。TAs主要在这些药用植物须根中合成,其生物合成途径中腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT)、托品酮还原酶I(Tropinone reductase I,TRI)和莨菪碱6β-羟化酶(Hyoscyamine 6β-hydroxylase,H6H)及其编码基因已经鉴定,但是TAs生物合成途径中还有诸多酶有待研究。鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)催化鸟氨酸脱羧生产腐胺,腐胺是TAs的通用基本前体物质。为研究ODC在TAs生物合成的功能,本文测定了天仙子转录组,并从中发现了天仙子ODC基因(HnODC),对HnODC进行了生物信息学分析、表达分析和酶活性研究。本文测定并分析了天仙子须根和叶片的转录组。天仙子根和叶测序结果的clean reads比率分别为99.75%和97.94%。在差异表达基因分析中,发现了8107个基因在根和叶中表达存在显著性差异,其中4186个基因在根中表达量比在叶中表达量高,占差异表达基因总数的51.63%。天仙子TAs合成途径中已经鉴定的PMT、TRI和H6H等基因在天仙子须根中表达量远高于其在叶片中的表达量,并进一步采用qPCR验证了这些基因的表达量。TAs基因在须根中的高表达量与TAs在须根中合成这一事实吻合。通过对天仙子转录组数据的分析,发现了7条吡哆醛依赖脱羧酶第四组基因的转录本,其中编号为comp39535C0Seq1的转录本最有可能是天仙子鸟氨酸脱羧酶基因(HnODC),该转录本与已知的天仙子TAs合成途径基因的数字表达模式十分相似,即在须根中高表达。随后,采用RACE技术克隆了HnODC的全长cDNA,生物信息学分析显示HnODC与其他植物的ODC,尤其是曼陀罗ODC的序列相似度很高;基于qPCR的组织表达分析印证了转录组测序的结果,即HnODC在须根中高表达。用MeJA处理,HnODC的表达量得到显著提高,这与天仙子PMT受到MeJA诱导表达类似。为验证HnODC编码蛋白质具有催化鸟氨酸生成腐胺的功能,在大肠杆菌中表达该基因,并采用Ni离子柱亲和层析技术纯化得到了带有组氨酸标签的HnODC,其分子量为50 kDa左右,与其理论分子量吻合,也与已经报告的烟草ODC(NgODC)和古柯ODC(EcODC)分子量相当。用鸟氨酸饲喂纯化的重组HnODC,发现其能够将鸟氨酸转化为腐胺,证明HnODC确实具有鸟氨酸脱羧酶的功能。最后对HnODC的酶动力学特征进行了分析。HnODC的Km值为3.40 mM,Vmax值为2.095 nmol.min-1.μg-1,Kcat值为1.809 s-1。结果表明HnODC对鸟氨酸的亲和性低于NgODC和EcODC,但其催化效率高于NgODC和EcODC。综上所述,基于天仙子转录组测序,筛选得到了HnODC基因,该基因在须根中高表达,且收到MeJA诱导;HnODC能够高效催化鸟氨酸转化为腐胺。HnODC的克隆和酶活性鉴定为进一步研究其在TAs生物合成中作用奠定了基础。
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