轮状病毒(Rotavirus)是具有三层蛋白衣壳结构的双链RNA病毒。它是能够引起人类和动物腹泻的重要病原之一,尤其以引起婴幼儿的秋季腹泻最为常见。每年因轮状病毒感染而住院的患儿高达数百万,其中甚至有数十万感染患者出现死亡情况。轮状病毒感染的临床表现主要为发热,呕吐,腹部疼痛,随之出现水样便或蛋花样便,严重者则伴随因腹泻导致的脱水。现有的治疗轮状病毒感染的药物主要有抗病毒药,免疫调节剂,消化道黏膜保护剂,微生态制剂,并且治疗时伴随水和电解质补充。但由于婴幼儿的体质特殊以及上述药物会产生不同程度的毒副作用,现阶段并没有完善的治疗轮状病毒肠炎的方法。从中医角度来说,治疗轮状病毒肠炎时需从行气健脾,温中和胃,止吐止泻方面入手。中药由于其毒副作用小,调理患儿肠道的方式较为柔和,因此可以弥补现有药物所存在的治疗缺陷。茜草(Rubia cordifolia)根一直作为传统止血剂被沿用至今,而其茎叶部分的水煎液却广泛被民间视为止泻剂用于治疗秋季腹泻。以茜草藤为君药的复方制剂儿泻停颗粒也已在临床应用多年,用来治疗儿童的秋季腹泻。但其止泻作用机理目前尚不明确。考虑到轮状病毒是导致秋季腹泻的最主要病原,本文第一部分将初步探讨茜草藤水煎液体外抗轮状病毒的作用及可能的抗病毒机理。同时由于儿童的药物治疗途径和给药剂量与成人不同,因此儿科用药需要考虑到儿童的年龄,体重,生理情况以及治疗要求等等。而对于患有秋季腹泻并伴随呕吐的儿童,口服颗粒剂或汤剂十分困难。而不论是茜草藤水煎液还是儿泻停颗粒对于患有腹泻并伴有呕吐的儿童来说服用起来都十分困难,因此需要优化和开发新的药物剂型来搭载茜草藤提取物。直肠给药和经皮给药是儿科常见的给药方法,前者适用于病情严重或者无法口服药物的患者;后者给药方法简单,过程无痛,是儿科治疗的理想给药途径。因此,本文第二部分重点探讨了如何选用生物相容性材料并结合计算机辅助设计、3D打印、光学固化等技术制造出新型直肠给药和经皮给药制剂,搭载解热镇痛消炎类药物,用于缓解轮状病毒肠炎患儿的疼痛情况。此种剂型的应用今后也将延伸至搭载治疗轮状病毒感染的药物如儿泻停,茜草藤提取物或其他药物,从而达到理想的给药效果。第一部分1.茜草藤提取物的细胞毒性测试目的考察茜草藤提取物对MA-104细胞株的细胞毒性以及探讨其最大无毒浓度。方法蒸馏水连续提取1 kg茜草藤后合并滤液,冷冻干燥后保存。使用前将茜草藤干粉溶解于蒸馏水中制备成样品溶液。将1000 mg/mL的茜草藤溶液连续2倍稀释成十个不同浓度的样品溶液。当96孔板中的恒河猴肾细胞MA-104长成单层后,用以上十个不同浓度的茜草藤提取液分别加入于细胞中共同培养48小时。于96孔板每孔中分别加入WST-8溶液培养2小时后,酶标仪450 nm波长下读取每孔读数并分析比较不同浓度样品处理细胞的生存率。结果当茜草藤提取液的浓度低于62.5 mg/mL时,比较对照组与样品组织间的细胞生存率无显著性差异。提取液浓度高于62.5 mg/mL时,对照组细胞生存率低于对照组,并且随着提取物浓度的上升呈现下降趋势。结论茜草藤水提物浓度低于62.5 mg/mL时对MA-104细胞没有细胞毒性,因此其最大无毒浓度为62.5 mg/mL。低于此浓度的样品溶液可以用于后续实验。2.茜草藤水提物体外对轮状病毒在MA-104细胞上增殖的抑制作用目的考察茜草藤水体物能否抑制轮状病毒在体外培养的MA-104细胞中的增殖。方法将62.5 mg/mL的茜草藤水提物连续2倍稀释成0.12,0.24,0.49,0.98,1.95,3.91,7.81,15.63,31.25,62.5 mg/mL十个浓度。在混合处理分析法中,先将以上不同浓度的提取物和用胰酶活化的轮状病毒共同培养2小时。将药物与病毒的混合物作用于96孔板中长成单层的MA-104细胞,并培养48小时。显微镜下观察细胞形态,并用WST-8试剂检测每组细胞的细胞生存率。吸取培养板中每组的上清液用轮状病毒检测试剂盒与实时定量聚合酶链式反应法(qPCR)检测轮状病毒存在情况;在后处理分析法中,先用轮状病毒处理MA-104细胞,后加入不同浓度的茜草藤提取液。用显微镜下观察细胞形态,WST-8试剂检测每组细胞的细胞生存率,轮状病毒检测试剂盒与qPCR法测定每组上清中轮状病毒存在情况。结果混合处理分析法结果显示,随着提取物浓度的增加,显微镜下观察到的细胞病变程度加剧,WST-8检测到细胞生存率下降。但轮状病毒试剂盒检测发现加入低浓度提取物时可检测到轮状病毒存在,高浓度时未检测到。qPCR结果证明随着提取物浓度的增加,病毒数量呈现下降趋势。后处理分析法结果与混合分析法一致。结论轮状病毒数量会随着茜草藤水提物浓度的增加而降低。茜草藤水提物可体外抑制轮状病毒在MA-104细胞中的增殖。3.茜草藤水提物体外抑制轮状病毒增殖的作用机理目的考察茜草藤水提物抑制轮状病毒在MA-104细胞上增殖的作用机制。方法将混合处理分析和后处理分析中96孔板中的上清液取出后,用DAPI-甲醇混合液作用于余下的单层MA-104细胞。DAPI-甲醇溶液使细胞染色15分钟后用甲醇溶液冲洗细胞表面。同时将只用不同浓度提取物处理,没有感染病毒的细胞作为对照组,只用病毒感染不用提取物处理的细胞作为病毒组,均使用DAPI试剂染色。荧光显微镜下观察染色的细胞核形态。结果DAPI染色结果显示,病毒组的个别MA-104细胞出现凋亡情况;加入茜草藤水提物后,被病毒感染的细胞的凋亡数量随着加入提取物浓度的增加而增加;而对照组中随着提取物浓度的增加,细胞未出现凋亡情况。结论轮状病毒可以引起轻微的细胞凋亡,而茜草藤水提物可以促进病毒感染细胞的凋亡,从而终止病毒在其宿主的增殖。第二部分1.非可溶性栓剂材料的选取及载药后物理性质、药物释放的测试目的考察两种医用硅胶搭载不同药物后的物理性质和药物释放情况,选取适合的硅胶制作新型栓剂的材料。方法选取两种医用硅胶Silastic(?)Q7-4720和MED-4901作为栓剂基质,分别与四种不同浓度的镇痛药物双氯芬酸钠,布洛芬,盐酸利多卡因,酮洛芬相互混合,60℃-70℃固化18小时后显微镜下观察药物在基质中的分布状况。分别测定和比较载药材料的杨氏模量参数、残余伸度以及药物从材料中的释放。结果盐酸利多卡因在两种硅胶中均以晶体形式存在且分布均匀,其余三种呈现球形微粒状。对于硅胶Silastic(?)Q7-4720,随着利多卡因浓度增大,材料的刚度、弹性,抗塑性变形能力均有所下降;双氯芬酸钠、布洛芬和酮洛芬浓度的增加对材料刚度和弹性的影响不大,但抗塑性变形能力降低。相比于其他药物混合Silastic(?)Q7-4720,利多卡因-Silastic(?)Q7-4720释放药物最快,但很快达到稳态浓度,不能实现长期释药;30天内释药量由高到低为酮洛芬,布洛芬,双氯芬酸钠,三者均能达到缓慢长期释放药物的效果。对于MED-4901,加入酮洛芬后不能成型,但加入其他药物后,随着浓度增加,材料的刚度、弹性保持稳定并低于药物-Silastic,抗塑性变形能力稳定且强于另一种材料。MED-4901加入药物后,30天内药物的累积释放量由高到低为布洛芬,双氯芬酸钠,利多卡因,其中布洛芬和双氯芬酸钠可实现长期释放。结论MED-4901加入药物后的物理性质优于Silastic(?)Q7-4720,药物释放曲线类似,因此更适合作为栓剂基质。盐酸利多卡因-MED能够实现快速释药,双氯芬酸钠-MED可实现最长时间释药,因此盐酸利多卡因和双氯芬酸钠被选为用于栓剂测试的目标药物。2.3D打印栓剂模具以及非可溶性栓剂的药物释放目的用3D打印的方法制造出不同大小和形状的栓剂模具并测试基于此模具制造出的非可溶性栓剂的药物释放情况。方法应用计算机辅助技术设计在Solidwork软件中设计得到不同的栓剂模具,借助数字光学处理3D打印机,以光敏树脂为材料,将以上栓剂模具打印出来。并将筛选出的硅胶-药物组合添加于模具中制作成形。根据国际标准化组织制定方法测定此栓剂的生物相容性,并且测定栓剂释放药物的情况。结果以光敏树脂为材料的栓剂模具可以被打印成形,且制备的非可溶性栓剂生物相容性良好。含有1%,5%盐酸利多卡因的非可溶性栓剂3小时内达到70%左右的释药量,4天达到最大释药量;含有1%,5%双氯芬酸钠的非可溶性栓剂30天内可释放96%的双氯芬酸钠。结论结合计算机辅助技术、3D打印可以制作出个体化的栓剂。且利多卡因非可溶性栓剂适用于快速止痛,双氯芬酸钠栓剂适用于长期止痛。3.GeIMA微针贴剂的制备及物理性质的测定目的用生物相容性良好的材料GelMA(Gelatin Methacrylate)制备成新型微针贴剂且测定其物理性质。方法选取两种不同类型不同浓度的动物源性明胶A、B,分别加入过量的甲基丙烯酸酐,于50 ℃,pH 7.4的条件下通过取代反应化学合成GelMA,分子量12400的透析袋透析5天去除杂质后冷冻干燥制成GelMA干粉。用H1-NMR测定取代效率并分析制备的GelMA的纯度。将GelMA干粉溶解于蒸馏水中制备成1%,2.5%,5%,7.5%,10%的GelMA溶液,分别加入光引发剂Irgacure 2959后紫外光下固化得到GelMA凝胶。比较不同种类不同浓度GelMA溶液制成凝胶的流变学性质。并将上述几种GelMA溶液注入3M微针模具中制成微针,比较其机械性能的差异。结果实验制备得到的两种GelMA纯度均达到70%以上。A、B型GelMA凝胶的硬度G’均随着浓度的增加而增大,同一浓度时,A型凝胶的硬度高于B型凝胶,且由A型凝胶制成的微针的机械强度远优于B型凝胶。结论GelMA可以用光固化的方法制备成微针,且以A型明胶合成的GelMA物理性质更好,制备的微针机械性能更强。因此,A型GelMA是制备可降解型微针贴剂的良好材料。