质膜型Ca~(2+)-ATPase基因的分离与表达研究

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在农业生产中,植物病害的为害造成了巨大的损失,而生产上采用的高毒、高残留农药对产品和环境均造成严重的污染,已成为制约我国无公害农产品生产可持续发展的突出问题。研究开发可持续、环保型控制技术是解决这一问题的关键。β-氨基丁酸(BABA)是从经暴晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸,具有高效、广谱的诱抗活性,可诱导多种作物抵抗由卵菌、真菌、细菌、病毒和线虫引起的病害,保护植物免受病害为害。要开发利用BABA诱导植物抗病潜能,创新有害生物综合治理途径与技术,必须进一步认识BABA的诱导抗病机理。从功能基因组学角度分析BABA诱导植物防御反应过程中信号互作功能基因群的表达特征,是揭示寄主—病原物互作的分子机制的新思路。过去,基于技术局限,关于植物诱导抗病的基因转录调控分析大多集中在若干已知PR蛋白和个别SA信号传导路径中的几个基因上。现在,利用功能基因组学的多项技术,可以明确更多应答诱抗时植物体内转录发生改变的基因,从而更准确、全面地认知植物诱导抗病行为机制。本研究以番茄为材料,利用cDNA-AFLP基因转录谱分析技术研究番茄根部组织应答BABA诱导后基因转录谱,取得的结果如下:1.由于植物总RNA提取的质量具有很强的组织特异性,对试验中常用的TRIzol Reagent、RNAplant、TRIpure Reagent等三种RNA提取试剂盒进行了番茄成熟老化组织RNA提取效果的研究,发现RNAplant能有效从多种成熟组织中提取纯度高、完整性好的RNA,符合需要总RNA质量较高的分子试验要求。2.采用25mmol/L BABA溶液处理番茄六叶期幼苗,蒸馏水处理作为对照,运用cDNA-AFLP差别显示技术对基因转录谱进行分析。从显示出的约5000个转录基因片段(Transcript-derived fragments,TDFs)中发现了23个受BABA诱导上调基因片段(BABA Induced Fragment,BIF),6个诱导下调片段。通过克隆测序最终得到12个转录上调基因序列。用生物信息学方法分析这12个cDNA片段的功能,可将其分为5种类型:①防卫反应基因:BIF13,BIF14为病程相关蛋白基因P69家族成员,它们具有蛋白水解酶功能;②转运蛋白基因:BIF2,BIF3、BIF6、BIF17,BIF4,负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输;③信号传导蛋白:BIF5为Ca2+绑定蛋白,结合游离Ca2+,参与Ca2+信号传导;④大分子蛋白相关基因:BIF 1为协助蛋白复性的分子伴侣蛋白编码基因;⑤功能未知基因:BIF10、BIF11、BIF12。3.对上述基因片段进行序列分析,发现BIF3、6、17三个基因片段序列长度一致,同源性高达99%,为编码细胞逆境信号通路中的钙调转运蛋白酶(Calcium transporting-ATPase,Ca2+-ATPase)基因片段。利用分子系统发育分析对Ca2+-ATPase基因家族进行了细分;在此基础上,依据同源克隆的原理,结合步进PCR和RACE方法获得这个质膜型(Plasma membrane-type,PM-type)Ca2+-ATPase全长cDNA序列,基因全长3389bp,开放阅读框为3090bp,编码1029个氨基酸的蛋白质。这是首次在茄科类植物中克隆到PM型Ca2+-ATPase。4.利用Northern Blotting分子杂交对靶标Ca2+-ATPase基因受BABA诱导的时空规律进行了研究,结果显示,Ca2+-ATPase基因在根中表达量最高,叶其次,茎中最弱;基因的转录水平在6—12h达到最高,持续到72h仍有微量表达。5.利用生物信息学手段对靶标基因编码蛋白的理化性质和二、三级结构、代谢途径进行分析,并构建了该蛋白的理论三维模型,发现该基因编码的多肽链有7个基序(motif),4个保守功能结构域(domain),8个跨膜螺旋,都与蛋白的活性有关,该基因参与Ca2+信号代谢途径。对靶标基因进行了分子系统发育分析,找到了该基因在生物界进化的地位。6.利用SMART和Primer Extension技术相结合,构建了一个富集BABA诱导抗性相关基因的cDNA全长文库,原始文库的滴度达到为4.4×106,重组率为96%,插入片段大小分布在400—1800bp,平均大小为700—1000bp;为克隆响应BABA诱导的其他重要抗性基因全长cDNA奠定了基础。7.利用了Ca2+-ATPase的保守区段设计基因特异引物(Gene Specific Primer,GSP),在两个经受低温锻炼的柑橘品种中进行半定量RT-PCR,试验结果表明此基因广泛存在于植物组织内部,属诱导表达型基因,积极参与了植物逆境信号转导过程。
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