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犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是一种引起犬出血性肠炎或心肌炎的DNA病毒。犬的各种传染病中,犬细小病毒病发病率、死亡率均为最高,为犬的主要传染病之一。目前该病还没有有效的治疗方法,CPV抗体及其诊断、治疗试剂将有助于该病的防治。
本研究从临床疑似犬细小病毒感染病死犬的粪便中分离CPV,应用F81细胞扩毒,PEG6000沉淀法、超速离心法、红细胞吸附浓缩法来纯化病毒,对分离病毒用血凝及血凝抑制、免疫电镜和PCR三种方法予以鉴定,继而以纯化的CPV作为抗原免疫健康产蛋鸡,收集鸡蛋,用PEG6000法、水稀释法、无机物沉淀法分离纯化卵黄抗体;用琼脂扩散法测定IgY效价。在动物实验中,以纯化的CPV毒株实验室人工攻毒感染3月龄幼犬,4只出现明显临床症状时,用特异卵黄抗体和血清进行治疗,考察其疗效。进而在广州的三家动物医院治疗发病犬,从较大样本中统计治愈率。
研究结果显示,分离的CPV接种F81细胞产生明显细胞病变,能被犬细小病毒阳性血清所抑制,并凝集猪红细胞效价达27;免疫电镜观察外观呈圆形、直径约20nm病毒粒子;根据犬细小病毒的基因组设计特异引物进行PCR扩增,得到犬细小病毒VP2基因组的特异性片段,确定分离毒株为CPV。命名为CPV-fjw株。最后一次免疫后第20d,收集鸡蛋和血清,分别对水稀释法+无机物沉淀法纯化的卵黄抗体(IgY1)、PEG6000沉淀法+无机物沉淀法纯化的卵黄抗体(IgY2)以及鸡血清分别进行琼脂扩散试验。用琼脂扩散法测定不同方法纯化得到的卵黄抗体效价分别为1:8,1:4,血清抗体效价为1:32。较大规模临床实验结果表明,卵黄抗体的治愈率为33.3%,血清的治愈率为80%。
本研究在广东广州地区成功分离到犬细小病毒CPV-fjw株,为我国该病流行病学提供一定的参考资料,并且针对该病原体制备了IgY抗体和血清抗体,应用抗体的中和特性于临床治疗。但是,在实验过程中,IgY的分离纯化一度成为难题,主要困难在于如何去除高浓度的脂类,提高IgY的纯度的同时不会让IgY流失过多。目前IgY的广泛应用往往受制于IgY的分离纯化,不分离纯化又降低了使用效果。如何将鸡蛋中的卵黄抗体提取率提高,是决定IgY能否被广泛应用的一个重要前提。本研究中卵黄抗体效价偏低估计是流失过多或者活性被破坏,因此很难投入市场并得以推广。卵黄抗体的纯化必须考虑到其提取率、流失率、脂类残留、纯度、安全性、经济、是否适用于工业化生产,希望在今后的研究中加以改进。