论文部分内容阅读
最近发现的杆状病毒11k基因家族(InterProdatabaseaccessionnumber：IPR009313)存在于至少16种以鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒中，功能未知。本文选取11k基因家族中的斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus，SpltMNPV)开放阅读框97(openreadingframe97，ORF97)(命名为Splt97基因)和苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒[Autographacalifornica(Ac)MNPV]ORF108(命名为Ac108基因)为研究对象，对这两个同源基因的转录、翻译、在病毒结构中的定位以及基因缺失对病毒在感染细胞中产生情况等进行了初步研究。
splt97基因位于SpltMNPV基因组94466nt～94804nt之间，阅读框全长339bp，编码112个氨基酸，预计分子量为13.2kDa；Ac108基因位于AcMNPV基因组94392nt～94709nt之间，全长318bp，编码的蛋白包含105个氨基酸，预计分子量为11.8kDa。序列分析表明Splt97和Ac108为两个同源蛋白，氨基酸序列相似性为21％，其所有的同源蛋白仅存在于以鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒中，氨基酸序列相似性介于8-50％之间。这些同源蛋白氨基酸序列的中间都存在一个由21个氨基酸残基组成的强疏水性跨膜螺旋结构域。
本文首先根据Splt97和Ac108基因序列设计两对引物，分别以SpltMNPV和AcMNPV基因组DNA为模板进行PCR扩增，将得到的这两个基因克隆至原核表达载体pQE30，在原核细胞中实现了基因的融合表达。纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，制备了两种蛋白的多克隆抗体。Splt97多克隆抗血清与SpltMNPV感染的Spli-221细胞总蛋白进行的杂交，显示一条13kDa的特异杂交带，而Ac108蛋白在AcMNPV感染的Sf-9细胞中多克隆抗体显示带的大小约为27kDa，表明Ac108蛋白可能以复合体或与其它蛋白相连的形式存在。
RT-PCR分析结果表明，Splt97和Ac108基因在病毒感染细胞中的转录均从6h开始就可以检测到，一直持续到感染后96h。5RACE分析发现，Splt97基因的转录起始于ATG上游-12nt的杆状病毒早期启动子ACATT中的嘌呤碱基C，Ac108基因的转录起始于ATG上游-9nt的杆状病毒晚期启动子TTAAG中的第一个嘌呤碱基A。与基因从病毒感染后6h开始转录不同的是，Spit97和Ac108蛋白的表达均是从感染后48h才开始检测到。Westernblot实验证明，Splt97和Ac108蛋白均定位于包涵体来源型病毒粒子(occlusion-derivedvirus，ODV)的囊膜上，是ODV囊膜相关蛋白。核质分离实验表明在病毒感染的晚期Ac108蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。
本文第二部分内容是采用ET-克隆的方法，在大肠杆菌DH10B细胞中成功实现了从AcMNPVBacmid基因组中敲除Ac108TH基因片段，并同时在该位点插入了氯霉素基因Cm。将经过转座带有绿色荧光蛋白基因(greenflucrescenceprotein，gfp)和多角体基因(polh)的重组Bacmid转染Sf-9细胞，24h后荧光显微观察发现细胞中能够产生绿色荧光，出现荧光的细胞分布比较均匀，从转染后24-96h有荧光的细胞数量基本不变。转染48h后能够看到多角体，比较均匀地分布在少量细胞中，到96h有多角体出现的细胞数量没有增加。空斑测定结果显示转染细胞不能形成空斑，荧光分布呈单细胞状态，边缘细胞没有被感染现象。重组Bacmid转染Sf-9细胞，病毒上清的滴度测定结果全部为零。这些结果充分表明Ac108缺失导致芽生型病毒粒子(buddedvirus，BV)不能产生，或者是产生的BV完全没有感染性。
SDS-PAGE和间接免疫荧光分析发现，缺失Ac108基因的重组病毒影响了GP64的积累，从转染后48h细胞中可以检测到GP64蛋白，一直到96hGP64蛋白在量上没有明显的变化，这与对照在这个过程中有了成倍的增加，并能够出现一条小分子降解带不同。缺失Ac108基因同时能导致VP39蛋白合成的阻断，重组Bacmid转染的细胞中没有检测到VP39蛋白的存在。证明基因的缺失还能够影响到核衣壳蛋白的合成。
采用Bac-to-Bac表达系统将包含启动子和poly(A)加尾信号的Ac108和Splt97基因大片段转座至重组Bacmid中进行repair和replace实验，结果表明repair和replace均没有使病毒功能得到恢复。是否基因片段的敲除影响了相邻基因的转录和表达需要进一步的实验来验证。