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目的探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对转CD基因的肝癌SK-HEP-1细胞CD基因表达量有无影响;讨论组织特异性CD/5-FC系统热化疗对裸鼠肝癌的抑制作用。方法将质粒PCD2和G1AFPCDNa在感受态细菌中大量扩增,碱法抽提质粒,质粒PCD2用BamH 1酶和EcoR 1酶切鉴定,质粒G1AFPCDNa用Sal 1酶切鉴定并测序;用脂质体法分别转染肝癌SK-HEP-1细胞,以含400mg/lG418RPMI1640培养液选择培养,14天后挑选抗性克隆并大量扩增,RT-PCR检测目的基因的表达情况;在96孔细胞培养板中分别对两种转基因SK-HEP-1细胞进行前药5-FC热化疗,MTT法测活细胞比率并计算细胞杀伤率,并比较两种转基因的细胞对5-FC的敏感性;随后收集热疗后残余SK-HEP-1-G1AFPCDNa细胞并抽提细胞总RNA,用实时荧光定量PCR ( Real-Time PCR )检测热化疗前后SK-HEP-1-G1AFPCDNa细胞CD基因的表达情况,以比较热化疗前后目的基因表达有无差异。随后将90只裸鼠随机分为三组:对照组、AFPCD热疗组、AFPCD非热疗组,每组30只,脾内注射法建立肝癌动物模型,对照组腹腔注射生理盐水,热疗组腹腔注射43℃5-FC,非热疗组腹腔注射不加热5-Fc,观察各组裸小鼠的肝癌生成率、肝癌数目、光镜以及电镜下肿瘤组织病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数,裸鼠生存期等指标,RT-PCR检测各组肿瘤组织中CD基因的表达情况,同时检测裸鼠胰腺,胃,结肠组织中CD基因有无表达。结果质粒PCD2用BamH 1酶和EcoR 1酶切鉴定可见1.5k酶切片段;质粒G1AFPCDNa用Sal 1酶切鉴定可见1.9k酶切片段;基因测序与GenBank中公布的E- CD序列一致,脂质体法将PCD2和G1AFPCDNa转染肝癌SK-HEP-1细胞后,RT-PCR证明CD基因整合并能够稳定表达,转染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1细胞比转染PCD2的SK-HEP-1细胞CD基因的表达活性明显增强; 5 - FC转基因细胞热化疗证明SK-HEP-1 -G1AFPCDNa比SK-HEP-1-PCD2对5-FC更敏感,其IC50分别为0.12mmol/l和0.98mmol/l,表明在组织特异性驱动子TRS驱动下,目的基因的表达活性明显增强;实时荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的ct值29.53±1.1974,beta-actinct值20.82±2.7385;热化疗后CD基因表达的ct值30.285±1.201, beta-actinct值21.225±2.237;行△△Ct法进行相对定量比较无明显差异(P>0.05, t=1.4521,ν=38),表明热疗不会影响转染基因的表达活性。将成功转染G1AFPCD基因的SK-HEP-1细胞注射脾脏,同时药物干预后四周后,对照组有30只成瘤,成瘤率为100%;非热疗组有24只成瘤,成瘤率为80%;热化组9只成瘤,成瘤率为30%;肿瘤肝脏种植率非热疗组与对照组无明显差异(P>0.05),而热疗组与对照组比较有显著差别(P<0.01),平均肝癌数( x±s)对照组为13.6±8.79个,非热疗组为5.6±2.85个,热疗组为0.6±0.65个,热疗组与非热疗组平均肝癌数目明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);普通病理可见对照组肿瘤组织中,肿瘤细胞生长活跃,并可见细胞核分裂相和瘤巨细胞;而在非热疗组肿瘤组织中,瘤细胞数减少,肿瘤细胞空泡变性,细胞核皱缩,边集甚至消失,特别是在热疗组肿瘤组织标本中更加明显,仅残留少量肿瘤细胞,并可见散在的成纤维细胞,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞;透射电镜下可见对照组肿瘤细胞呈不规则形,体积较大,核大,核仁明显,核分裂相易见,细胞浆内细胞器丰富,但无明显的凋亡小体;热疗组大量肿瘤细胞呈胞体凝缩,胞质浓缩,核糖体及线粒体聚集,细胞核固缩,核碎裂等表现,并可见大量有完整细胞膜包裹的凋亡小体,各组肿瘤标本中均有CD基因的表达,胰腺,胃,结肠组织中没有CD基因的表达。结论1脂质体能将质粒PCD2和G1AFPCDNa转染入肝癌SK-HEP-1细胞,并且能稳定整合持续表达。2转染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1细胞比转染PCD2的SK-HEP-1细胞CD基因的表达活性明显增强,表明AFP驱动子能驱动CD基因在SK-HEP-1细胞中高效表达。3转染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1细胞比转染PCD2的SK-HEP-1细胞在43℃孵育下对前药5-FC的敏感性明显提高,表明在组织特异性驱动子TRS驱动下,目的基因的表达活性明显增强。4转染G1AFPCDNa的肝癌SK-HEP-1细胞热化疗前后CD基因表达量无差异,表明热疗不会影响CD基因在细胞及组织中的表达。5 SK-HEP-1细胞转染基因后与未转染基因细胞的致瘤性没有发生变化。6热疗联合组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)系统腹腔化疗能明显减少裸鼠肝癌发生率,可有效地抑制肝癌的形成,并能显著提高肝癌裸鼠的生存期。7组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)系统腹腔化疗对肿瘤组织的靶向性比较明确,对正常组织的损伤比较小。