第一部分 慢性间歇低氧诱导大鼠高血压模型的建立目的:探讨建立一种模拟临床阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)病理生理特征的高血压动物模型,并评估其有效性。方法:以固定体积塑料密封舱作为间歇低氧仓,并通过交替输入氮气与空气的方式来模拟OSA低氧环境。采用电磁阀和计算机系统来控制造模过程中气体的切换,使用90s循环队列,其中前30s向舱内输注纯氮气使仓内氧气浓度降到最低(约5%),随后60s泵入空气替换舱内氮气使氧浓度恢复至21%。低氧时间为8h/天,共21天。16只SD大鼠随机分为常氧组(room air,RA组)和慢性间歇低氧组(chronic intermittent hypoxia group,CIH组)。常氧组放置于常温、常压、常氧状态下,CIH组置于间歇低氧环境中。实验开始前和实验后每周检测血压,并于实验结束后记录大鼠肾交感神经放电活性(renal sympathetic nerve activity,RSNA),此后处死大鼠取血清检测去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)水平。结果:(1)与RA组比较,CIH大鼠从第二周开始,血压出现明显升高,差异有统计学意义,这种升高状态一直维持到第三周。(2)CIH可导致大鼠RSNA升高,表现出长时程易化现象。(3)CIH大鼠血清NE水平升高。结论:(1)CIH可以诱导大鼠血压升高。(2)CIH可诱导大鼠RSNA出现长时程易化。第二部分 RhoA/Rho激酶信号通路在慢性间歇低氧诱导肾交感神经长时程易化及血压升高中的作用研究背景:OSA是一种以睡眠期间断发生上呼吸道阻塞为特征的疾病,是继发性高血压的重要因素之一。虽然目前对于OSA导致高血压的发病机制已经提出了多种假说和机制,但仍需更多证据来支持这些假说或进一步阐明。目的:本研究目的是探讨氧化应激及RhoA/Rho激酶(ROCK)途径在CIH诱导肾交感神经长时程易化及血压升高中的作用。方法:40只成年雄性SD大鼠(150-190g)随机分为对照组(RA),低氧+DMSO或者生理盐水组(CIH-V),低氧+GKT137831(Nox1和Nox4抑制剂)组(CIH-G),低氧+Y27632组(ROCK抑制剂)(CIH-Y),低氧+乙酰半胱氨酸(N-Acety-L-Cysteine,NAC)组(CIH-N),每组各8只。低氧处理组每天常压下慢性间歇低氧8h,RA组置于常压常氧环境下处理。CIH-Y组予以腹腔注射Y27632(10mg/kg/d),CIH-G 组予以腹腔注射 GKT137831(40mg/kg/d),CIH-N组予以腹腔注射NAC(300mg/kg/d),实验开始前和实验开始后每周监测血压。实验结束后,记录大鼠肾交感神经(renal sympathetic nerve activity,RSNA)活性,之后处死大鼠并收集血清和肾组织进行分子生物学检测,Tunel法检测肾组织凋亡水平。结果:(1)CIH组大鼠血压自第二周开始出现上升,随后持续升高直到第三周。CIH大鼠血液中去甲肾上腺素(noradrena1ine,NE)水平升高,并出现RSNA长时程易化。(2)Y27632治疗能降低CIH诱导的血压升高和RSNA过度激活。GKT137831和NAC可以抑制氧化应激水平和活性氧的产生,降低RSNA活性,同时降低RhoA/ROCK的表达。结论:(1)CIH可以诱导大鼠血压升高和RSNA过度激活。(2)CIH能增强大鼠氧化应激水平。氧化应激可能通过调控RhoA/ROCK途径影响CIH诱导的大鼠高血压状态。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)和Nox4源性ROS及RhoA/ROCK途径可能部分参与了 CIH诱导大鼠高血压的发病机制。(3)CIH增加肾组织细胞凋亡。抑制氧化应激和RhoA/ROCK途径可以改善CIH诱导的肾损伤。第三部分 Ang 1-7在慢性间歇低氧诱导肾交感神经长时程易化及血压升高中的作用研究背景与目的:临床上观察发现,OSA患者存在着肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)系统的激活,而RAS系统的激活是血压升高的重要原因,也是OSA导致心血管疾病的重要机制之一。血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)-血管紧张素(1-7)[angiotensin(1-7),Ang-(1-7)]-mas轴是一条新通路,可能对Ang Ⅱ具有抗平衡作用。但是目前对Ang(1-7)的研究有限,且研究结果并不一致。本研究目的是探讨CIH诱导大鼠高血压与肾损伤的关系,以及Ang(1-7)干预对CIH诱导的高血压大鼠RSNA及肾损害的影响。方法:将大鼠随机分为常氧对照组(Norm组),常氧+Ang(1-7)组(NormAng组),CIH组和CIH + Ang(1-7)(CIHAng组)。在实验开始和实验后每周末检测尾动脉收缩压水平。实验结束时记录肾交感神经活性(RSNA)。采用免疫组织化学和免疫印迹方法检测结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和肿瘤转化因子 β(transforming growth factor-β,TGF-β)的水平;肾组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)含量的检测采用化学发光法;肾组织中3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)的含量检测和表达采用免疫组织化学法及 ELISA 法,低氧诱导因子-1α(hypoxiainduced factor-1α,HIF-1α)水平采用免疫组化和免疫印迹法检测。肾组织细胞凋亡水平采用TUNEL染色进行观察,同时联合免疫印迹法检测caspase3和caspase12的表达。结果:(1)与Norm组和NormAng组比较,CIH组大鼠在低氧暴露后第二周出现血压升高,直至实验结束时,差异有统计学意义。Ang(1-7)干预后,CIHAng组大鼠血压出现下降,与CIH组比较,差异有统计学意义。(2)RSNA记录显示,CIH组大鼠基线RSNA水平显著高于CIHAng组、Norm组和NormAng组。尽管经Ang(1-7)干预,CIHAng组RSNA基线水平仍然高于Norm组,差异有统计学意义。(3)免疫组化显示,CIH组大鼠炎症因子IL-6、TNF-α和HIF-1α的表达显著升高,而Ang(1-7)的慢性干预可显著降低上述炎症因子的水平,与CIH组比较差异有统计学意义。ELISA(IL-6和TNF-α)和免疫印迹(HIF-1α)结果也支持以上结论。(4)CIH组大鼠SOD和CAT水平较对照组显著下降,而MDA较对照组显著升高,差异有统计学意义。CIHAng组大鼠的SOD和CAT水平较CIH组有显著升高,MDA含量较CIH组相比有显著下降。免疫组化结果显示,与Nrom组比较,CIH组肾组织3-NT含量显著升高,其主要表达在胞浆,而Ang(1-7)的慢性干预后可显著降低3-NT含量,与CIH组比较差异有统计学意义。但即使经过Ang(1-7)干预,CIHAng组的氧化应激水平仍然高于Norm组和NormAng组。(5)免疫组化和Western blot结果显示,CIH组大鼠的纤维化水平显著高于Norm组大鼠,表现为CTGF和TGF-β的表达水平显著高于Norm组和NormAng组。ELISA显示,CIH组大鼠血清AngⅡ水平显著高于Norm组和NormAng组,而CIHAng组AngⅡ水平显著下降,与CIH组比较,差异有统计学意义。(6)TUNEL和凋亡相关蛋白结果显示,CIH组大鼠肾组织细胞凋亡率明显高于Norm组和NormAng组,Ang(1-7)的治疗可减轻CIH对大鼠肾组织的损伤。结论:(1)CIH可以诱导大鼠血压升高和RSNA过度激活,而Ang(1-7)可以降低CIH诱导的大鼠血压升高和肾交感神经的过度激活。(2)CIH能导致大鼠氧化应激水平、炎症水平和纤维化水平显著升高,并激发肾交感神经长时程易化;而Ang(1-7)可在一定程度上降低大鼠氧化应激水平、炎症和纤维化水平,并降低血压水平和RSNA。因而认为Ang(1-7)可通过抑制炎症、氧化应激和纤维化水平而改善受损的肾交感神经压力反射,降低血压。(3)CIH诱导大鼠肾组织细胞凋亡,而Ang(1-7)的干预能改善大鼠肾组织损伤。在治疗CIH诱导的高血压和肾功能损害方面,Ang(1-7)可能是一个潜在、有前景的治疗策略。