起源于髓系造血干细胞的异常分化和增值的急性髓细胞白血病（Acutemyeloid leukemia，AML）是成年人白血病中最常见的一种恶性克隆性疾病。目前AML的主要治疗方案为化学药物治疗法，由于其病因的复杂性，化学治疗方法不能对所有的患者有效，并且副作用较大。造血干细胞的移植虽然能够根治白血病，但是应用范围受限。近年来随着细胞遗传学及分子生物学的进展，人们发现了几种分子水平上的损伤与AML的发病有关，这就为靶向药物的开发奠定了基础。AML患者中存在30%的Fms样酪氨酸激酶3(FMS-Like Tyrosine Kinase3)的基因突变，是AML中出现最为频繁的突变之一。FLT3基因突变与AML的发生密切相关，具有FLT3突变的患者往往有着很不利的预后状况。存在于FLT3蛋白的近膜结构域的内部串联重复序列突变FLT3-ITD是AML中最主要的基因突变。另一种FLT3突变是FLT3催化结构域上的点突变，最常见的是天冬氨酸835位的突变（FLT3T835）。近膜结构域上还存在少数缺失/插入突变。FLT3-ITD的出现干扰了近膜结构域对受体激酶活性的负向调控，而FLT3-TKD突变能够直接影响激酶的活性，这两类突变都可以导致FLT3配体非依赖性自身磷酸化，从而激活下游信号转导通路，致使造血细胞的异常增殖和分化，进而最终导致白血病的发生。FLT3在急性髓系白血病中所起到的重要作用使其成为诊断AML的重要依据，并且成为靶向治疗AML的重要靶标，相关药物治疗法也于近期开始研究和开发。目前人们已经发现几种针对FLT3的小分子抑制剂，然而迄今为止，这些抑制剂临床应用的效果并不理想，特异而高效的FLT3靶向药物还未被发现。FLT3小分子抑制剂的专一性，有效性以及抗复发性等还有待进一步提高，其在AML的靶向治疗中的应用有着广阔的前景。本研究致力于在已知的酪氨酸激酶抑制剂中筛选新型的FLT3小分子抑制剂，所以首先我们需要寻找一种特异性灵敏底物、构建FLT3的激酶活性分析方法，以此筛选出新型的FLT3抑制剂。经过前期研究和探索，我们成功自己设计、表达并纯化了一种包含FLT3自磷酸化位点的特异性灵敏底物——GST-FLT3S，其表达与纯化是通过大肠杆菌和GST树脂进行的，纯化后的GST-FLT3S纯度可以达到99%。同时，为了顺利进行FLT3激酶活性分析，我们还表达了带有六个组氨酸标签的正常型和突变型的FLT3催化结构，分别由杆状病毒转染Sf9表达细胞系，其细胞抽提物经由镍柱纯化得到融合蛋白。通过免疫印记和抗酪氨酸磷酸化抗体PY20检测重组蛋白FLT3的自磷酸化，结果证明目的蛋白具有激酶活性，能够被杆状病毒表达系统有效表达。我们随后建立了一套以FLT3特异性底物GST-FLT3S为基础，应用免疫印迹法检测FLT3激酶活性检测体系，通过反应条件的探索确定了酶活反应体系的底物用量和反应时间。激酶活性检测体系分析了两种FLT3突变型的激酶活性的变化，相比FLT3WT，两种突变型FLT3D835Y和FLT3D835H有显著增高的激酶活性。同时，由于免疫印记操作稍显繁琐，所以我们尝试了将底物GST-FLT3S固定于GST树脂上，并通过荧光显微镜来检测GST-FLT3S磷酸化的方法。这种方法虽然易于操作，节约时间，但其结果较难进行定量分析，所以FLT3抑制剂的筛选依然采用免疫印记的方法。确定了酶活的分析方法后，我们将GST-FLT3S用于检测小分子酪氨酸激酶抑制剂的抑制活性，得到结果是FLT3抑制剂可以有效抑制GST-FLT3S的磷酸化，而其他几种靶点不是FLT3的抑制剂效果并不明显。这证明了GST-FLT3S确实可以作为特异底物用于新型FLT3抑制剂的筛选。为了寻找FLT3的新型抑制剂，我们筛选了激酶抑制剂文库中的化合物。激酶抑制剂文库中包含80种小分子ATP竞争性激酶抑制剂，其中也包括几种已知FLT3抑制剂。经筛选，我们确定了一种抑制效果明显、且至今未被报道的FLT3小分子抑制剂，名称为SU11652。SU11652已经被发现为其他酪氨酸激酶抑制剂，而我们的研究证明它同时也是FLT3的抑制剂，而且有着更好的抑制效果。为了具体研究SU11652对FLT3的抑制作用，我们从分子水平上研究了SU11652对FLT3的半数抑制浓度。结果证明SU11652能够有效抑制两种突变型FLT3D835Y和FLT3D835H的激酶活性，只是半数抑制浓度比FLT3WT略高。在细胞水平上，我们应用FLT3ITD突变阳性的白血病细胞系MV-4-11研究了SU11652对FLT3突变阳性的细胞MV-4-11的抑制作用，发现SU11652能够抑制MV-4-11的生长，通过形态学研究表明在SU11652作用下，MV-4-11的细胞形态发生明显变化，细胞缩小，而且不存在分裂期的细胞，对照组细胞的生长情况和细胞形态却没有受到影响。这证明SU11652对MV-4-11的抑制作用具有选择性。经过进一步对SU11652具体的抑制机制的研究，包括细胞凋亡，细胞周期以及信号通路的抑制作了具体的研究。我们首先采用Annexin V和PI染色来研究SU11652对MV-4-11的细胞凋亡的影响。结果表明SU11652处理后的MV-4-11凋亡细胞百分比明显提高，这说明SU11652可以在一定程度上引发MV-4-11的细胞凋亡。我们接下来采用了乙醇固定细胞，应用PI染色细胞中DNA的方法鉴别细胞在细胞周期中各个阶段的百分比，结果显示SU11652能有效的减少G2以及S期的细胞百分比，有着明显的细胞周期抑制作用。为了确定FLT3参与的信号通路是否被抑制，我们应用免疫印迹的方法检测了FLT3，Erk，Akt以及Stat5的磷酸化程度，同时引用管家基因GAPDH作为上样对照。在SU11652的作用之后，MV-4-11细胞中FLT3，Erk，Akt以及Stat5的磷酸化程度显著下降，这说明SU11652对FLT3自磷酸化起到了抑制的作用，由此抑制了整个FLT3下游的蛋白磷酸化，从而抑制了细胞信号传导通路的活化，最终对MV-4-11细胞生长产生抑制作用。本研究通过构建FLT3特异性的底物GST-FLT3S建立了FLT3抑制剂的筛选系统，并且从中发现了一种新型的FLT3小分子抑制剂SU11652。SU11652与临床现有的FLT3抑制剂相比，有着更强的抑制效果与更好的专一性，在细胞水平上，SU11652可以有效地而且有选择性的杀伤FLT3突变的白血病细胞系。所以，SU11652作为FLT3的抑制剂，是十分有潜力的治疗AML的药物备选，有希望作为临床药物被应用到AML的治疗中。