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Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)是天然免疫中的一个重要的通路,其中,β干扰素TIR结构域衔接蛋白TRIF(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β)是该信号通路中重要的一个组成部分。在本文中,我们首次克隆了青鱼TRIF的编码区(CDS),并对青鱼TRIF的功能做了初步的研究。取得了以下结果:1.青鱼TRIF的CDS序列由1680个碱基组成,编码559个氨基酸,用ExPASy分析其序列,预测结果显示青鱼TRIF的分子量约为63 kDa,等电点为6.43。通过对其结构的分析可知,青鱼TRIF蛋白结构域中包含了一个TIR结构域。通过遗传进化发育树比对结果分析显示青鱼的TRIF与同鲤科的草鱼TRIF氨基酸序列的同源性最高,为94.5%。由此可以看出青鱼的TRIF基因在同类鲤科鱼中的进化是相对比较保守的,但青鱼TRIF与人类和小鼠的氨基酸序列比对后同源性只有37.2%和34.4%,说明青鱼TRIF在进化的过程中氨基酸序列发生了较大的变化,蛋白质的功能和结构也有可能发生较大的改变。2.在研究TRIF基因在青鱼各个组织中的转录水平的实验中,青鱼TRIF基因在所有选定的组织中都能够稳定表达,包括肠、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和鳃六个组织,当青鱼被草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)和鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)感染后,肝脏、肠和脾脏组织中TRIF的mRNA转录水平有显著提升,其他组织升高不显著。3.在研究青鱼TRIF在体外表达的实验中,我们通过免疫印迹实验发现青鱼TRIF可以在EPC细胞和293T细胞中表达,蛋白大小约为75KD。4.为了了解青鱼TRIF在细胞中的定位,我们做了免疫荧光实验,通过共聚焦显微镜发现青鱼TRIF蛋白分布在细胞质中。5.我们通过双荧光素酶报告系统实验分析发现青鱼TRIF能够强烈地诱导斑马鱼干扰素、EPC干扰素、青鱼干扰素和人NF-κB启动子的表达,且剂量式增加。6.为了研究青鱼TRIF能否具有抗病毒的能力,我们在EPC细胞中过表达的青鱼TRIF质粒24小时之后再用病毒感染细胞,我们发现青鱼TRIF能够在EPC细胞中有效地抑制GCRV和SVCV病毒的复制。7.在研究bcTRAF2能否和bcTRIF共同影响干扰素和NF-κB启动子活性的研究中,我们共转了两种质粒,结果显示bcTRAF2能使bcTRIF上调干扰素和NF-κB启动子的能力下降。综上所述,青鱼TRIF是在抗病毒免疫信号通路中重要的一个分子,在宿主对抗GCRV和SVCV的天然免疫应答中起着重要的作用。本论文的数据为将来深入研究青鱼TRIF在天然免疫系统中的作用机制奠定了基础。