口腔鳞状细胞癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,其中又以舌鳞癌最为常见。舌鳞癌恶性程度高,易复发转移。肿瘤的复发和转移是肿瘤患者预后不佳的重要因素,因此对肿瘤侵袭转移机制的研究将会为肿瘤的治疗及改善患者预后提供重要的依据。分子生物学和基因工程技术的进步为肿瘤的生物治疗创造了良好的基础,生物治疗有望成为继手术、化疗、放疗后的第四种治疗方向。肿瘤免疫治疗和肿瘤基因治疗是肿瘤生物治疗的主要手段。基因治疗是随着DNA重组技术的成熟而发展起来的,是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗技术,它是通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA序列导入人体靶细胞去纠正基因缺陷以发挥治疗作用。虽然现在己经发现了与口腔鳞癌发生、发展有关的多种基因,但人们仍在继续找寻与口腔鳞癌相关的新基因,尝试建立与口腔鳞癌相关的特异性基因谱学,寻找基因治疗的靶点,为口腔鳞癌的治疗提供科学的理论和实验依据。口腔鳞癌的复发转移是一个多步骤且复杂的过程。肿瘤细胞从原发部位游离是转移的最初始步骤,也是发生转移的先决条件。因此,如果能制止这一过程的发生,将有可能从源头上控制肿瘤的转移。2012年,Stephen等研究发现一种名为FRMD4A(FERM domain-containing protein4A)的蛋白在头颈癌中起着关键作用,FRMD4A蛋白能促进癌细胞生长,并且FRMD4A蛋白的高表达与头颈部鳞状细胞癌复发转移风险高度相关。因而,我们推测FRMD4A蛋白也可能在口腔鳞癌侵袭转移中发挥重要作用,FRMD4A蛋白极有可能成为口腔鳞癌新的治疗靶点。长期以来,有关FRMD4A的研究鲜见报道,因而对其结构、功能等方面的了解甚少,但近年来随着研究的深入,FRMD4A逐渐得到广泛关注,FRMD4A基因是近年来被克隆鉴定的新基因,位于人类染色体10p13。FRMD4A基因表达产物FRMD4A蛋白与小鼠EpH4上皮细胞同源,属FERM超家族成员,含1039个氨基酸,是一类具有FERM结构域的蛋白。FERM结构域的命名即来源于红细胞中的Band4.1(简称4.1R、four point one)、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)与膜突蛋白(moesin)这4种蛋白的首字母。Band4.1是最先被确定的含FERM结构域蛋白,发挥连接细胞质膜与细胞骨架,协助维持细胞形态和膜稳定性的作用。而其他3个成员主要存在于上皮细胞富含肌动蛋白的皮层区域和细胞的外膜,参与细胞形态构建、细胞黏附和迁移,调节膜蛋白的定位及其相关功能,调控细胞骨架排布,并参与肿瘤侵袭与转移。FERM结构域广泛存在于动物细胞多种蛋白中,可作为上游信号,被激活后释放FERM蛋白活性位点,通过FERM结合不同配体或调节蛋白其他结构域结合下游信号分子,参与多种细胞形态调节和信息传递;或只依赖自身作用于下游因子,积极广泛地影响多种细胞生理和病理进程,含FERM结构域蛋白在参与结构组成、蛋白转移和信号转导等功能调控中发挥着重要作用,与肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关。2008年的全基因组关联性研究以及2012年在亚洲人群中大规模的全基因组关联研究均发现FRMD4A基因在人体对药物依赖性方面发挥着重要作用。2010年Ikenouchi证实FRMD4A基因能编码骨架蛋白,并调节乳腺上皮细胞粘着连接[8]。降低含FERM结构域蛋白活性的研究已有报道,如应用siRNA干扰FAK基因表达可降低乳腺癌AU-565细胞的迁移能力[9]；应用JAK抑制剂CP690、550可减少免疫抑制治疗常见的副作用[m]。RNA干扰是一种内源基因沉默机制,由双链RNA介导,能特异性地抑制同源基因的表达,最终致使基因沉默。RNA干扰具有高效、稳定、特异性强等特点,已成为目前生物医学研究领域最活跃的热点之一。目前,关于FRMD4A在舌鳞癌中的表达情况和作用在国内外尚未见报道。本实验首次运用qRT-PCR和免疫组化检测FRMD4A与舌鳞癌的关系,并通过基因沉默逆向验证FRMD4A与舌鳞癌恶性程度的关系,以探讨FRMD4A在舌鳞癌发生发展中所起的作用,为控制舌鳞癌提供新的靶点,并为进一步研究提供实验依据。本研究包括以下三章：第一章FRMD4A在舌鳞癌组织中的表达及意义目的：1.探讨FRMD4A基因和蛋白在舌鳞癌组织中的表达情况及意义。材料和方法：1.收集广东省口腔医院病理科2010年6月至2013年6月石蜡标本108例,其中舌鳞癌组织78例,白斑15例,癌旁正常舌组织(距病灶>1.5cm,病理确诊为正常上皮)15例。舌鳞癌组织中高分化20例,中分化47例,低分化11例；男40例,女38例；年龄37岁～70岁；TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期31例,Ⅲ期+Ⅳ期47例；有淋巴结转移35例,无淋巴结转移43例。另收集广东省口腔医院颌面外科2013年3月至2013年6月手术切除舌鳞癌及癌旁正常新鲜舌组织各10例。2.应用qRT-PCR检测舌鳞癌及癌旁正常新鲜组织中FRMD4A mRNA的表达情况。3.应用免疫组织化学染色技术检测舌鳞癌、舌白斑和癌旁正常舌组织石蜡切片中FRMD4A蛋白表达情况。结果：1.qRT-PCR结果显示FRMD4A mRNA在舌鳞癌组织中的表达显著高于其在癌旁正常舌组织中的表达(方差齐性检验显示方差不齐,使用校正t检验,P<0.01)。2.免疫组化结果显示FRMD4A蛋白阳性反应主要位于细胞浆中,呈棕黄色颗粒状反应,表达主要在上皮基底层,并随肿瘤恶性程度增加有向棘层扩散的趋势；FRMD4A蛋白在舌鳞癌组织中的表达(50/78,64.1%)明显高于白斑组(5/15,33.3%)及癌旁正常组织组(2/15,13.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。白斑组与癌旁正常组织组差异无统计学意义(P>0.05)。3.舌鳞癌切片中,FRMD4A蛋白在出现淋巴结转移患者中(28/35,80.0%)的表达显著高于无转移组(22/43,51.2%),在TNM分期晚期(Ⅲ+Ⅳ)(36/47,76.6%)表达显著高于早期者(Ⅰ+Ⅱ)(14/31,45.2%)；FRMD4A蛋白表达情况与患者年龄、性别、组织分化程度差异无统计学意义。小结：1. FRMD4A mRNA在舌鳞癌组织中的表达显著高于其在癌旁正常舌组织中的表达。2. FRMD4A蛋白高表达与淋巴结转移和肿瘤临床TNM分期有关,与患者年龄、性别、组织分化程度等因素无显著相关性。第二章舌鳞癌细胞系中FRMD4A mRNA的表达及CAL-27细胞基因沉默模型的构建目的：1.检测各舌癌细胞系和正常口腔上皮细胞中FRMD4A mRNA表达情况,为后续实验提供参考。2.构建沉默FRMD4A基因的细胞模型,将FRMD4A-siRNA体外转染舌鳞癌CAL-27细胞,并观察转染效率及检测干扰率。材料和方法：1.选取四株恶性程度不同的舌鳞癌细胞株UM-1、UM-2、SCC-9和CAL-27,并以正常口腔上皮细胞作为对照。应用qRT-PCR检测各细胞株中FRMD4A mRNA表达水平。2.根据前期结果,以舌鳞癌细胞株CAL-27作为实验对象,构建沉默FRMD4A基因的细胞模型,采用脂质体介导法,利用Lipofectamine(?) RNAiMAX将小干扰片段FRMD4A-siRNA转染入CAL-27细胞,荧光倒置显微镜观察荧光FAM标记的siRNA转染效率。3.应用qRT-PCR检测转染后CAL-27细胞中FRMD4A mRNA表达变化,Western blot分析转染后FRMD4A蛋白表达变化情况。结果：1.与正常口腔上皮细胞组相比,各舌鳞癌细胞株中FRMD4A mRNA相对表达量有不同程度上升,其中SSC-9组表达量为正常组1.2倍,CAL-27组表达量为正常组1.66倍,UM-2组表达量为正常组2.68倍,UM-1组表达量为正常组5.01倍,除SSC-9外,另外三株差异有统计学意义。2.荧光倒置显微镜下观察显示,当Lipofectamine(?) RNAiMAX终浓度为2.5μL/mL和FRMD4A-siRNA终浓度为50pmol/L时,FAM标记的siRNA转染效率较高。3. qRT-PCR结果显示,实验组中,siRNA-2干扰效果最明显,FRMD4A mRNA相对空白组降低了94%,差异具有统计学意义(P<0.05)；Western blot结果显示,实验组中,siRNA-2使FRMD4A蛋白表达下调,抑制率为71.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。小结：1. FRMD4A mRNA在各舌鳞癌细胞株中有不同程度的高表达。2. FRMD4A-siRNA能有效降低FRMD4A在舌鳞癌CAL-27细胞中mRNA和蛋白的表达水平。第三章沉默FRMD4A基因对舌鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移及侵袭的影响目的：1.探讨FRMD4A在舌鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。材料和方法：1.构建沉默FRMD4A基因的CAL-27细胞模型,同时设立阴性对照组和空白对照组。2.沉默FRMD4A基因后,应用CCK-8法检测FRMD4A对CAL-27细胞体外增殖的影响,流式细胞术检测沉默FRMD4A基因对CAL-27细胞周期分布的影响。3.沉默FRMD4A基因后,应用划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测FRMD4A对CAL-27细胞体外迁移侵袭能力的影响。结果：1.CCK-8法检测结果显示转染后在24h及48h检测时点,实验组细胞体外增殖活性显著降低,而转染72h后,随着RNA干扰效应减弱,实验组细胞增殖活性与对照组相比,差异不显著。流式细胞术检测结果显示,转染后实验组细胞G1期分布比率上升,G2+S期比率下降,差异有统计学意义。2.划痕愈合实验显示划痕48h后,空白对照组、阴性对照组细胞向划痕边缘爬行速度快,划痕宽度明显变窄,细胞甚至已填满划痕区域,实验组细胞爬行速度较慢。Transwell侵袭实验显示与对照组相比,实验组穿膜细胞数显著减少。小结：1.沉默FRMD4A基因的表达可降低CAL-27细胞的体外增殖能力,造成细胞G1期阻滞现象。2.沉默FRMD4A基因的表达可降低CAL-27细胞体外迁移和侵袭能力。全文结论：1. FRMD4A mRNA在舌鳞癌组织中的表达显著高于其在癌旁正常舌组织中的表达；FRMD4A蛋白高表达与舌鳞癌患者发生淋巴结转移和TNM晚期密切相关。2. FRMD4A mRNA在各舌鳞癌细胞株中有不同程度的高表达；FRMD4A-siRNA能有效降低FRMD4A在舌鳞癌CAL-27细胞中mRNA和蛋白的表达水平。3.体外沉默CAL-27细胞的FRMD4A基因可降低细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力,使细胞发生G1期阻滞。