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根瘤菌遗传多样性和共生专一性的研究有助于根瘤菌资源的分类鉴定和精准利用。同一种内的根瘤菌株具有不同的表型生理生化特征,与不同紫花苜蓿品种的共生效应也存在差异。因此,根据根瘤菌的表型差异以及与苜蓿品种的共生效应,可以将根瘤菌划分为不同的生物型。本研究以甘肃农业大学分别设立在甘肃省白银市会宁县会师镇、武威市凉州区黄羊镇和兰州市安宁区的牧草试验站的甘农3号、甘农9号、陇中、清水和WL168HQ紫花苜蓿品种为材料,从根瘤、根表皮、根中柱、茎、叶、花、种子等不同组织、根际土壤和田间土壤中分离根瘤菌株,对其进行表型生理生化特征分析、16S rRNA基因限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、16S rRNA基因测序、多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)、结瘤固氮基因测序和共生效应测定。通过研究根瘤菌表型多样性、遗传多样性和共生专一性,划分根瘤菌生物型,并对根瘤菌生物型和苜蓿品种高效匹配的专一性共生系统进行转录组学分析,旨在探寻根瘤菌生物型与苜蓿品种专一性共生的分子基础,为丰富专一性共生根瘤菌资源,强化苜蓿与根瘤菌的高效共生育种,培育高质量共生型苜蓿品种提供理论依据。结果表明:(1)分离获得53株根瘤菌,其中以内生根瘤菌为主(43株),占总菌株的81.1%;非内生根瘤菌有10株,占总菌株的18.9%。根瘤菌表型多样性丰富,内生根瘤菌相对非内生根瘤菌表型多样性更丰富。碳氮源利用谱广泛,抗生素和染料抗性较强,对低浓度的NaCl、弱酸、弱碱和高温抗性较强。中华根瘤菌属(Ensifer)和根瘤菌属(Rhizobium)菌株在77%的相似性水平上分别聚集为6个和8个群,在100%的相似性水平上分别聚集为25个和20个群。不同栽培区域、苜蓿品种和组织部位来源的Ensifer属和Rhizobium属菌株表型多样性有差异,分别是来自兰州市安宁区牧草试验站(香农-威纳多样性指数分别为1.099和1.733)、WL168HQ苜蓿(1.099和1.733)和根瘤(0.757和1.332)的菌株表型多样性最丰富。(2)根瘤菌株遗传多样性丰富,53株根瘤菌共产生22种16S rRNA-RFLP酶切类型。不同栽培区域、苜蓿品种和组织部位来源的菌株多样性差异明显,来自武威市凉州区牧草试验站(多样性指数为1.864)、甘农3号苜蓿(1.268)和根际土壤(1.386)的根瘤菌株遗传多样性最丰富。53株根瘤菌经16S rRNA和MLST分析分别与模式菌株Ensifer meliloti LMG 6133~T、Rhizobium radiobacter ATCC19358~T和Rhizobium rosettiformans W3~T聚集在一起,序列相似性均大于97%,被定种为E.meliloti(32株),R.radiobacter(20株)和R.rosettiformans(1株)。Rhizobium属菌株均不能扩增到nodC和nifH,不同E.meliloti菌株的nodC和nifH基因有共同来源,序列相似性达97%~100%;nifH基因多样性高于nodC基因。遗传多样性与表型多样性没有直接关系。(3)根瘤菌株与不同紫花苜蓿品种的共生效应存在差异。就单独接种效应,菌株QL2与甘农3号苜蓿、菌株G3L3与甘农9号苜蓿、菌株LP3与清水苜蓿共生匹配和适应能力强;在陇中和WL168HQ苜蓿上,不同菌株接种对植株共生能力的提升效果存在差异。从总体共生效应来说,32株E.meliloti菌接种后,甘农3号、甘农9号和清水苜蓿品种上共生指标值的分散程度均小于陇中和WL168HQ苜蓿品种;即菌株在前3个苜蓿品种上具有相似的共生效应,在后2个苜蓿品种上的共生效应差异明显。说明E.meliloti菌株与紫花苜蓿品种的共生效应主要由苜蓿品种基因型决定,其次为菌株,不同紫花苜蓿品种与根瘤菌株的相互识别能力和共生敏感性存在差异。(4)以主成分分析中对共生效应贡献率最大的地上干重指标,代表根瘤菌株与紫花苜蓿品种的共生效应,当接种根瘤菌的苜蓿品种地上干重显著高于(P<0.05)未接种处理CK时,将根瘤菌株与苜蓿品种共生效应标记为“正效应”E(Effective),显著低于(P<0.05)CK时标记为“负效应”I(Inhibitive),与CK差异不显著(P>0.05)时标记为“无效应”O(Noneffective)。以苜蓿品种甘农3号、甘农9号、陇中、清水和WL168HQ的顺序,将各根瘤菌株的共生效应标记符号进行合并,形成12种共生效应组合;根据效应组合中E、O、I组分数量的差异将所有菌株分为6种共生模型。共生效应组合EOOOO、OEOOO、OOEOO和OOOEO代表的菌株分别与甘农3号、甘农9号、陇中和清水苜蓿存在强烈的共生正效应专一性。EEOOO代表的菌株与甘农3号和甘农9号苜蓿存在共生正效应,OEOEO代表的菌株与甘农9号和清水苜蓿存在共生正效应。OIOEO代表的菌株与甘农9号苜蓿存在共生负效应专一性,与陇中苜蓿存在共生正效应专一性。OOOOI、OIOOO和OOOIO代表的菌株分别与WL168HQ、甘农9号和清水苜蓿存在共生负效应专一性。OOOII代表的菌株与清水和WL168HQ苜蓿均存在共生负效应。OOOOO代表的菌株与5个苜蓿品种均无共生效应。(5)32株E.meliloti菌经25种表型和6种共生模型,被划分为28种生物型。其中生物型Ⅲ(QL2)和Ⅴ(WLG1)与甘农3号苜蓿、生物型ⅩⅩⅦ(LL11)与甘农9号苜蓿、生物型Ⅳ(LL1)与清水苜蓿、生物型Ⅱ(LP3)和Ⅵ(G3L3)与陇中苜蓿存在强烈的专一性共生正效应,而生物型Ⅸ(G3L4)、Ⅹ(G3L7)、ⅩⅢ(G3L10和G3L13)、ⅩⅩⅥ(G3L12)、Ⅺ(G9L5)和ⅩⅨ(LL10)与甘农9号苜蓿、生物型Ⅻ(G3L9)与清水苜蓿、生物型ⅩⅦ(LL8)、ⅩⅩ(QL5)、ⅩⅩⅣ(QL4)和ⅩⅩⅤ(G3L5)与WL168HQ苜蓿存在专一性共生负效应。生物型Ⅷ(WLP2)与甘农9号和清水苜蓿及生物型ⅩⅩⅧ(LL2)与甘农3号和甘农9号苜蓿存在非专一性共生正效应,生物型ⅩⅫ(G9L7)与清水和WL168HQ苜蓿存在非专一性共生负效应。生物型ⅩⅣ(G9L3和G9L8)与甘农9号苜蓿存在专一性共生负效应,与清水苜蓿存在专一性共生正效应。生物型Ⅰ(G3L2)、Ⅶ(G3T2)、ⅩⅤ(G9L6、LL5、LL6)、ⅩⅥ(LL7)、ⅩⅧ(G3L6)、ⅩⅪ(G3L8)和ⅩⅩⅢ(G9L4)与5个苜蓿品种均无共生效应。所有生物型菌株接种WL168HQ苜蓿,均不产生专一性共生正效应,说明引进苜蓿品种与本地根瘤菌株的匹配能力较差。(6)选择4个专一性共生正效应生物型和2个非专一性共生正效应生物型菌株,分别接种相应的紫花苜蓿品种并进行根部转录组学分析,研究基于表型和共生效应划分根瘤菌专一性生物型的分子基础。不同生物型菌株在同一苜蓿品种上共生效应的差异是根瘤菌生物型划分的主要依据,而不同苜蓿品种对根瘤菌生物型划分的分子基础也不同。非专一性生物型菌株ⅩⅩⅧ(LL2)与Ⅷ(WLP2)接种甘农9号苜蓿的对比组合(表示为G9-LL2 vs G9-WLP2,下文同理),与其余3个苜蓿品种上的生物型对比组合没有共享基因,也没有显著富集的GO(Gene ontology)条目,说明基于甘农9号的生物型分类机制可能与其它3个苜蓿品种不同。对比组合G3-LL2 vs G3-QL2(非专一性与专一性)、Q-LL1 vs Q-WLP2(专一性与非专一性)和L-G3L3 vs L-LP3(专一性与专一性)共享68个差异基因,涉及到23条KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和5条未知功能代谢通路。专一性越强,生物型菌株间的差异基因数量和表达量越高,涉及到的代谢通路越多。权重基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)确定了3个与地上干重和地下干重均高度相关的模块,证实了根据地上干重衡量共生效应的可靠性。68个共享差异基因中,有45个差异基因与WGCNA模块的代表基因重叠,表明这些基因与根瘤菌生物型划分相关。它们参与了植物的次生代谢产物合成、碳水化合物代谢、氨基酸代谢以及激素信号传导途径,主要编码苜蓿品种的类黄酮等nod基因诱导剂信号因子和根瘤菌株的结瘤因子,在根瘤菌株与苜蓿品种的共生专一性、植物先天性免疫反应和根瘤菌对植物免疫反应的抑制方面有重要作用,这为甘农3号、陇中和清水苜蓿品种上根瘤菌生物型的划分提供了分子基础。