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转基因抗虫棉的大面积种植对防治靶标害虫、减少农药使用做出了重大贡献。然而,转基因抗虫棉的环境安全性也引起了大众的关注。因此,任何一种新培育的转基因抗虫棉上市之前必须经过严格的环境安全性评价,其中转基因抗虫棉对非靶标昆虫的影响是转基因棉环境安全评价的重要组成部分。在本论文中,我们研究了双价抗虫棉ZMSJ(表达Cry1Ac/Cry2Ab蛋白)和抗虫抗除草剂棉ZMKCKC(表达Cry1Ac/EPSPS蛋白)对非靶标昆虫中黑盲蝽Adelphocoris suturalis,家蚕Bombyx mori,意大利蜜蜂Apis mellifera和棉露尾甲Haptoncus luteolus的生态安全性,结果如下:1 Bt蛋白在转Bt基因抗虫棉—非靶标昆虫二级营养级之间的传递在本研究中,通过ELISA方法检测了两种转Bt基因抗虫棉花粉和叶片中Bt蛋白的表达量,以及取食转Bt基因抗虫棉后中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲体内Bt蛋白的残留量。结果显示,Cry1Ac蛋白在转基因抗虫棉ZMSJ和ZMKCKC花粉中的表达量在整个花期呈现明显的波动,其中在花期中期(7月20日)表达量最高;Cry2Ab在ZMSJ棉整个花期中稳定表达。转基因棉ZMSJ花粉和嫩叶中Cry1Ac的表达量均高于Cry2Ab。取食两种转Bt基因抗虫棉后,微量的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白可以传递到中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲体内。因此,两种转基因棉中Cry1Ac的表达量高于Cry2Ab,并且两种Bt蛋白可以通过取食从转基因棉传递到上述三种非靶标昆虫体内。2转Bt基因抗虫棉对非靶标昆虫的存活及生长发育影响通过室内活体取食生测的方法,研究了两种转Bt基因抗虫棉ZMSJ和ZMKCKC对意大利蜜蜂的存活率、取食行为以及家蚕的存活和生长发育的影响。结果显示,和对照棉Emian 24相比,取食转Bt基因抗虫棉ZMSJ和ZMKCKC花粉以后,意大利蜜蜂的存活率和总取食量没有受到显著影响;将10 mg/ml和100 mg/ml浓度的两种转基因棉花粉分别涂在桑叶上饲喂家蚕后,和对照棉相比,家蚕幼虫1至5龄的存活率、发育历期以及1至4龄末的眠重也无显著性差异。因此,转Bt基因抗虫棉ZMSJ和ZMKCKC对意大利蜜蜂和家蚕的存活以及生长发育相关的重要生命表参数没有显著影响。3转Bt基因抗虫棉对非靶标昆虫的血细胞数量及酚氧化酶活力影响本研究通过血细胞计数法和酶活力测定法研究了两种转Bt基因抗虫棉对意大利蜜蜂和家蚕的血细胞数量、酚氧化酶活力的影响。结果显示,取食了转Bt基因抗虫棉ZMSJ和ZMKCKC花粉以后,和对照棉Emian 24相比,意大利蜜蜂血细胞总数量和酚氧化酶活力无显著性差异;取食了10 mg/ml和100 mg/ml浓度的两种转基因棉花粉处理过的桑叶后,和对照相比,家蚕5龄幼虫的血细胞总数和种类、浆血细胞和颗粒细胞所占比例以及酚氧化酶活力均未受到显著影响。可见,两种转Bt基因抗虫棉对意大利蜜蜂和家蚕的血细胞和酚氧化酶活力没有显著影响。4转Bt基因抗虫棉对非靶标昆虫解毒、抗氧化、免疫相关基因表达量的影响在本研究中,通过荧光定量PCR技术探究了ZMSJ和ZMKCK两种转Bt基因抗虫棉对意大利蜜蜂解毒、抗氧化及免疫相关基因表达量的影响。结果显示,连续取食ZMSJ和ZMKCKC花粉7天后,和对照棉Emian 24相比,意大利蜜蜂解毒基因细胞色素P450氧化酶(Cytochrome P450 302A1,CYP302A1;Cytochrome P4504G11,CYP4G11;Cytochrome P450 6AS14,CYP6AS14)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CEST)、酯酶(juvenile hormone esterase,Jhe;esterase FE4-like,Cest04)、谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase delta 1,GSTd1;Glutathione S-transferase S3,GSTS3)的表达量无显著差异,抗氧化基因过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn superoxide dismutase 1,Cu Zn SOD1)和免疫相关基因肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein S2,Pgrp S2)、抗菌肽(Abaecin)、防御素(Defensin1;Defensin2)的表达量也无显著差异。表明两种转Bt基因抗虫棉对意大利蜜蜂的解毒、抗氧化、免疫相关基因表达量没有显著影响。5 Bt蛋白与非靶标昆虫中肠蛋白结合潜力评估本研究通过生物素标记竞争结合方法和Ligand blot配体杂交法,探究了中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicle,BBMV)蛋白是否可以与Cry1Ac和Cry2Ab蛋白结合。竞争结合结果显示,中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲有活性的BBMV蛋白不能与Cry1Ac或者Cry2Ab蛋白特异性结合,三种昆虫中肠内不存在特异的Cry1Ac或者Cry2Ab结合蛋白;Ligand blot结果表明,中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲中肠变性后的BBMV总蛋白同样不存在Cry1Ac或Cry2Ab结合蛋白,验证了生物素标记法的结果。综上所述,三种非靶标昆虫中黑盲蝽、意大利蜜蜂和棉露尾甲中肠内不存在Cry1Ac或者Cry2Ab结合蛋白。