哺乳动物的生精过程精细而复杂,多种调节因素参与生精细胞的产生、增殖和分化。精原干细胞是具有干细胞活性的生精细胞,是生精过程的起始。了解精原干细胞的分化机制将有益于揭示生精过程的起源,有益于人类利用精原干细胞、改造精原干细胞,从而促进医学、生物学以及畜牧业的发展。已证实:在整个生精过程中,生精细胞的发育过程经历了A0型精原细胞、A1-A4型精原细胞、In型(中间型)精原细胞、B型精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子。精原细胞的各个亚型细胞中,仅A0型精原细胞具有干细胞特性,即精原干细胞,是生精过程的起始,是一种未分化的精原细胞,由它而分化出A1-A4精原细胞及后续的各种生精细胞。然而从未分化的精原细胞分化为A1型精原细胞是一个非常很关键的时期。隐睾、VitA缺乏、Sertoli细胞中毒、放射损伤都能导致这个分化步骤的阻断。然而对如何调控未分化精原细胞的分化、在以上过程中这个步骤是如何停滞的还不得而知。c-kit是由原癌基因W locus编码的跨膜酪氨酸激酶受体,其配体是干细胞因子(SCF,由sl基因编码),c-kit受体和它的配体SCF在生精细胞的发育和分化过程中起着重要作用。在缺乏c-kit受体存在的情况下,精原干细胞无法分化。有研究表明:未分化的精原细胞不表达c-kit,而分化中的精原细胞有c-kit表达。精原细胞从未分化走向分化,c-kit从不表达走向表达,这其中c-kit与精原细胞分化过程的联系成为研究热点。研究并利用c-kit在精原细胞发育过程中的表达特点,对阐明精原细胞的分化过程将起重要作用。精原干细胞具有不对称分裂的特性,即可向下分化与自我更新,在如何维持精原干细胞自我更新功能的研究中,plzf的作用引人注目。已证实plzf缺陷的雄性小鼠出生后会出现渐进性的不育,表现为生精细胞耗竭,即精原干细胞自我更新能力缺失。作为一种抑制性的转录因子,研究plzf在睾丸发育过程中表达的变化、与代表分化事件的c-kit表达水平的对比,将从新的角度探索精原干细胞的发育过程。本课题通过研究不同发育阶段的大鼠睾丸内c-kit在核酸水平、蛋白水平上表达,探讨c-kit与精原细胞分化的相关性;在此基础上利用c-kit分选出A1-A4型精原细胞,探讨精原细胞分化比例;研究了与精原细胞自我更新有重要关系的plzf表达,且与c-kit的表达特点相对比,揭示未分化精原细胞走向分化与走向更新之间命运选择特点,并初步探讨其机制。一、c-kit在发育中的睾丸内的表达实验选择出生后1日龄组、9日龄组、30日龄组雄性SD大鼠,分别使用免疫组化和western-blot检测其睾丸内c-kit蛋白表达、RT-PCR半定量检测c-kit mRNA表达,并通过流式细胞技术检测了9日龄大鼠睾丸细胞内c-kit阳性细胞的比例。结果如下:1、c-kit蛋白和mRNA在大鼠睾丸发育过程中持续表达;表达位置和水平存在变化,出生后9日左右存在一个较高的水平表达,mRNA与蛋白表达变化一致;2、根据文献报道精原细胞发育的时相特点,结合本实验观察结果,9日龄睾丸出现的c-kit表达增高与精原细胞在此阶段出现大量分化相关;3、在9日龄大鼠睾丸中,光镜下可见的仅有支持细胞和精原细胞,通过流式细胞仪检测此特定日龄的大鼠睾丸细胞,结合此阶段的细胞类型,可认为:此时的精原细胞已出现分化,有(3.16±0.84)%的睾丸细胞表达c-kit,即分化的A1-A4型精原细胞,为进一步分离此亚型细胞提供了依据。以上结果表明:c-kit表达与精原细胞分化关系密切,精原细胞分化活动增多时,c-kit的表达升高,c-kit是精原细胞分化的标志物,其表达水平可代表精原细胞分化活动的强弱。二、A1-A4亚型精原细胞的分选实验选择9日龄雄性SD大鼠5只,无菌取其睾丸两步法消化成细胞悬液,percoll不连续密度梯度分离初步纯化出精原细胞,流式细胞分选技术分离出c-kit阳性细胞。结果如下:1、9日龄大鼠睾丸内出现了分化中的精原细胞,即A1-A4亚型精原细胞;其含量为(3.16±0.84)%;2、通过percoll不连续密度梯度分离,A1-A4亚型细胞含量可增加至(18.65±1.69)%,起到了明显的纯化作用;3、以c-kit为标志通过流式细胞分选,可成功分离出A1-A4亚型细胞,分离后的细胞活性良好,形态正常。以上结果表明:选择合适日龄动物,以percoll不连续密度梯度纯化精原细胞,再以c-kit作为标志物,通过流式细胞分选技术可成功分离A1-A4亚型精原细胞,为亚型精原细胞体外纯化策略探索了条件、提供了实验依据。三、精原干细胞增殖与分化的调节因素选择出生后1日龄、10日龄、30日龄雄性SD大鼠,RT-PCR、western-blot检测其睾丸内plzf表达水平,并与同日龄组c-kit表达特点相对比,结果如下:1、plzf在发育中的大鼠睾丸内有表达,1日龄睾丸中出现较高水平表达,随日龄增加,plzf表达水平降低;2、对比c-kit的表达情况,可知,在9日龄之前,c-kit表达随日龄增加而增加,plzf随日龄增加而下降;9日龄之后,c-kit与plzf表达水平均有下降;3、从1日龄到9日龄,plzf表达明显下降,同时c-kit表达明显升高,与此相对的发育过程是精原细胞增殖减少,而分化增多,反应出plzf参与维持干细胞自我复制,抑制分化的功能特点。以上结果表明:Plzf与精原细胞保持干细胞活性,即维持自我更新密切相关;c-kit与精原细胞分化密切相关,两者在精原细胞发育方式的选择中起着重要作用;plzf与c-kit表达的水平代表了精原细胞发育的方向,为今后体外调节精原细胞发育、人工干预生精过程提供了恰当的靶点和实验依据。结论1、c-kit在精原细胞分化过程中起重要作用,是精原细胞分化的标志,其表达水平可代表精原细胞分化活动的强弱;以c-kit为标志可成功分离A1-A4亚型精原细胞;2、plzf在精原细胞自我更新中起重要作用,一定时期内与c-kit表达水平相反,其表达水平可代表精原细胞自我更新活动的强弱。3、本文为进一步研究精原细胞发育方式的体外调控提供了实验依据。