论文部分内容阅读
卵巢癌早期缺乏典型的临床表现，因此常常进展至晚期阶段才被发现，其五年生存率不到30％，是女性生殖系统肿瘤最常见的死因，严重威胁着女性的生命安全[1]。目前，卵巢癌治疗主要采取手术治疗辅以化疗的联合疗法，但是超过70％的卵巢癌患者于初次治疗后复发，并易对化疗产生耐受或抵抗作用，因此，迫切需要探寻新的卵巢癌临床治疗方法[2]。 嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell immunotherapy，CAR-T）技术是基于抗体靶向技术的免疫治疗新方法，在血液系统恶性肿瘤治疗领域取得的突破性进展初步证实了其治愈肿瘤的潜力，使其成为近年来肿瘤免疫治疗领域的热点。受到CAR-T技术在血液系统恶性肿瘤治疗领域成功应用的鼓舞，CAR-T技术在实体瘤治疗领域的研究也相继展开，涉及间皮瘤、神经母细胞瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤类型，其中CAR-T技术在治疗脑胶质瘤、神经母细胞瘤的研究中取得了显著的治疗效果[3-4]。 CAR-T技术依赖抗体与抗原的特异性结合，使T细胞精准靶向表达目标抗原的肿瘤细胞，因此，合适的靶抗原是CAR-T技术应用的关键。理想的靶抗原应该具备在肿瘤组织中高表达而在正常组织中不表达或低表达的特点[5]。人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen2，Trop-2)是一种由人TACSTD2基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白[6]。研究表明，Trop-2是一种肿瘤相关蛋白，与肿瘤细胞的侵袭、转移及疾病的预后密切相关[7-10]。Trop-2在卵巢癌、胃癌、结肠癌、前列腺、胰腺癌等多种肿瘤细胞中过表达，而在人正常组织中不表达或低表达[7,9]，在肿瘤的靶向治疗中具有潜在的应用价值。因此，本研究选取Trop-2作为靶点，制备靶向Trop-2的CAR-T细胞并检测其对Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的杀伤作用，为卵巢癌的治疗提供新的方法。 方法: 1.Trop-2 CAR逆转录病毒表达质粒的构建及分析 以抗Trop-2 Fab及Linker(Gly4Ser)3为模板，根据In-Fusion PCR原理设计Vκ，VH的扩增引物;扩增Vκ，VH片段并将其与Linker(Gly4Ser)3连接成Vκ-(Gly4Ser)3-VH基因片段（抗Trop-2 scFv）;使用限制性核酸酶双酶切包含人IgG CH2CH3以及胞内信号转导区CD28、CD137、CD3ζ基因序列的逆转录病毒载体(SFG.CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ);应用In-Fusion PCR的方法将抗Trop-2scFv与线性化的逆转录病毒载体连接起来，构建成第三代Trop-2 CAR逆转录病毒表达质粒（Trop-2 CAR质粒），对重组质粒进行酶切鉴定及测序分析;使用293fectinTM Transfection Reagent将Trop-2 CAR质粒转染至293T细胞中，并通过Western Bolt检测其在293T细胞内的表达。 2.Trop-2 CAR-T细胞的制备 运用基因重组技术构建Trop-2 CAR-GFP质粒，并通过荧光显微镜观测病毒包装时的转染效率;通过逆转录病毒包装系统、293fectinTM Transfection Reagent及293T细胞制备Trop-2 CAR逆转录病毒上清;病毒上清经100 kD超滤管浓缩后，采用qPCR方法检测病毒滴度;用浓缩后的Trop-2 CAR逆转录病毒感染T细胞，获取Trop-2 CAR-T细胞并于体外扩增培养。 3.Trop-2 CAR-T细胞体外对卵巢癌细胞的杀伤作用 以转染的T细胞和CD19 CAR-T细胞作为阴性对照，采用CCK-8法检测靶向Trop-2 CAR-T细胞对Trop-2抗原表达不同的卵巢癌细胞OVCAR-3、HO8910、SKOV3、A2780，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375的杀伤作用;采用ELISA法检测Trop-2 CAR-T细胞细胞因子IFN-γ、 IL-2分泌的变化。 结果: 1.Trop-2 CAR逆转录病毒表达质粒的构建及分析 通过PCR扩增抗Trop-2的Vκ和VH基因片段分别为350bp和400bp左右;构建的Trop-2 CAR质粒经酶切鉴定及测序分析证实，其序列与预先设计的序列一致;Western Bolt检测结果表明，该Trop-2 CAR质粒能够在293T细胞中有效表达。 2.Trop-2 CAR-T细胞的制备 通过GFP示踪转染细胞，荧光显微镜下显示病毒包装的转染效率达80％;病毒上清经超滤浓缩10倍后的病毒含量均超过1.5×109 copies/ml; 3.Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用 Trop-2 CAR-T细胞对Trop-2表达阳性肿瘤细胞的杀伤作用随效应细胞与靶细胞比例(E∶T)的增加而增强，当E∶T为20∶1时，Trop-2 CAR-T细胞对表达不同水平Trop-2的卵巢癌细胞的杀伤效率范围为50％-85％(P＜0.05)，而各组效应细胞对Trop-2表达阴性的肿瘤细胞的杀伤效率间差异无统计学意义(P＞0.05);Trop-2 CAR-T细胞与Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的共培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌量明显高于CD19 CAR-T细胞组和T细胞组(P＜0.01)，而各组效应细胞与Trop-2表达阴性肿瘤细胞的共培养上清中细胞因子分泌量差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论: 1.成功构建Trop-2 CAR逆转录病毒表达质粒，其可通过逆转录病毒包装系统转染至293T细胞，并在293T细胞中有效表达; 2.成功制备第三代靶向Trop-2的CAR-T细胞，该Trop-2 CAR-T细胞能够分泌细胞因子IFN-γ、IL-2，可效杀伤Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞。