【摘 要】
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本论文主要内容是构建高产唾液酸酶的重组大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Sia(酶基因来源于乳酪短杆菌),研究重组唾液酸酶酶学性质,并通过全细胞催化、游离酶催化和固定
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本论文主要内容是构建高产唾液酸酶的重组大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Sia(酶基因来源于乳酪短杆菌),研究重组唾液酸酶酶学性质,并通过全细胞催化、游离酶催化和固定化酶催化三种方法生物转化多唾液酸神经节苷脂(GLS)产单唾液酸神经节苷脂(GM1)。 该重组菌经诱导产酶优化,在诱导剂浓度0.1mM下25℃诱导12h,酶活在摇瓶水平可达1.6万U/mL,比原始菌酶活提高120倍,3.7L发酵罐产酶达到24万U/mL。 通过筛选确定环氧载体LH305-HY03为固定化材料,优化酶固定化条件,确定唾液酸酶添加量100000U/g载体,在15℃、pH6.5条件下固定18h,得到固定化酶酶活88000U/g。 固定化酶的最适反应温度由游离酶的37℃提升至47℃,最适反应pH和游离酶同为5.5,在pH5.0到8.0范围内均较稳定。该固定化酶储存稳定性高,但重复使用6次后酶活损失近半。其Km和Vmax分别为3.88×10-3mmol/L和576mmol/min,Km值是游离酶的2.3倍,底物亲和力有所降低。 使用全细胞、游离酶和固定化酶分别进行GLS转化,转化后组分中GM1相对含量分别为75.4%、72.1%和68.7%。全细胞催化时菌体能代谢产物唾液酸,减弱产物抑制,但可能产生其他代谢副产物,增加分纯难度;游离酶催化虽无法消除产物抑制,但酶组分明确,副产物少,减少了分纯步骤;固定化酶转化效果虽不如细胞转化和游离酶转化,但因其良好的环境耐受性和可重复使用性,对GM1工业化大规模生产更具有现实意义。
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