大波斯菊苷抗血小板作用及机制研究

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文章分为以下几个部分:  第一部分:大波斯菊苷对血小板功能的影响  目的:传统中药车前草具有清热利尿以及心血管疾病的防治作用,车前草中黄酮类成分大波斯菊苷具有抗血小板的作用。研究不同浓度的大波斯菊苷对血小板在诱导剂的作用下的聚集功能、释放功能、黏附、扩展功能以及斑块回缩功能的影响。  方法:制备富血小板血浆和洗涤血小板,孵育不同浓度的大波斯菊苷,运用作用于血小板不同信号通路的诱导剂二磷酸腺苷(ADP),胶原(collagen),凝血酶(thrombin),花生四烯酸(AA)激活血小板,通过测定聚集率来验证大波斯菊苷对血小板聚集的影响;通过流式细胞计数仪检测大波斯菊苷对胶原诱导的血小板膜表面p-selectin表达以及JON/A的表达情况评价血小板α颗粒释放功能和药物对血小板inside-out信号;荧光显微镜观察大波斯菊苷对血小板在固化纤维蛋白原上的黏附、扩展功能的影响;观察大波斯菊苷对血小板斑块回缩的影响。  结果:①大波斯菊苷能够浓度依赖性的抑制胶原诱导的血小板聚集,而不影响ADP、凝血酶以及花生四烯酸诱导的血小板聚集。②大波斯菊苷能够抑制血小板ATP的释放以及p-selectin和JON/A的表达。③大波斯菊苷能够减少血小板在纤维蛋白原上的黏附数量,减少单个血小板的扩展面积。④大波斯菊苷抑制血小板的斑块回缩。  结论:大波斯菊苷通过影响血小板的聚集、释放、黏附、扩展以及斑块回缩功能发挥抗血小板作用,说明大波斯菊苷既影响了血小板由内向外的信号传导也影响了血小板由外向内的信号传导。  第二部分:大波斯菊苷抗血小板机制的研究  目的:由第一部分实验,观察到大波斯苷可影响血小板活化,它可以抑制血小板在胶原诱导下的血小板聚集,ATP的释放和p-selectin的表达等功能。本部分着重探索大波斯菊苷对血小板内信号通路的影响,以及大波斯菊苷对血小板内钙离子浓度变化的影响,研究其对血小板胞外钙离子内流和胞内钙池钙离子释放的影响,旨在揭示大波斯菊苷对血小板作用的机制。  方法:胶原诱导洗涤血小板活化,在达到血小板最大聚集率时裂解血小板,免疫印迹法检测胶原受体GP VI下游信号分子的表达情况,检测Syk-PLCγ2-PI3K/AKt-GSK3β信号通路中蛋白的表达情况;Flou-3-AM染血小板内游离钙离子,用流式细胞仪检测血小板荧光强度来测量血小板内钙离子的动态变化。  结果:①免疫印迹法显示,大波斯菊苷作用于血小板后,血小板内PI3K下游蛋白Akt和GSK3β的磷酸化水平降低。通过使用PI3K的抑制剂LY294002,发现单独使用大波斯菊苷和LY294002可以抑制血小板的聚集,两者同时使用则具有协同抑制作用。②大波斯菊苷可以抑制血小板内钙离子动员,它既可以抑制血小板激活后胞内钙离子的释放,又可以抑制血小板胞外钙离子的内流。  结论:大波斯菊苷抗血小板作用的机制主要是通过抑制血小板GP VI下游PI3K/AKt-GSK3β信号通路以及血小板内钙离子浓度的升高。
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