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背景人椎间盘退行性病变（intervertebral disc degeneration,IDD）是一种常见的退行性脊柱疾病,它会导致椎间盘突出、肌肉骨骼功能障碍、椎管狭窄、腰痛和生活质量降低等。遗传和环境因素是椎间盘退行性病变的危险因素,其中遗传因素是主要原因,占椎间盘退行性改变病例的70%。随着对椎间盘退行性病变发病机制研究的深入,表明在IDD的发生过程中退变相关基因有重要作用,但其异常表达机制及相互作用仍未明了。作为重要的调控分子之一,微小RNA（microRNA,miRNA）已被证实在很多疾病的发生、发展阶段起重要作用。故可推断其在椎间盘退变的进程中发挥重要作用。目前已有较多研究发现多种miRNA通过调控作用于多种细胞通路,参与炎症反应及细胞自噬、凋亡等多种途径影响椎间盘退变的发生、发展。近来,很多研究报道了 miR-424-5p参与调控细胞增殖、死亡、运动和血管新生等多个生物学过程,在退行性疾病和恶性肿瘤等多种疾病中表达异常。但是,miR-424-5p是否参与IDD的发生、发展以及二者之间的关联机制,目前仍未见相关报道。本论文通过相关实验,旨在探讨miR-424-5p在IDD中的可能作用和相关调控机制,为IDD的诊断及治疗提供新的理论依据。第一部分miR-424-5p、Bcl2、GPX4和ACSL4在退变椎间盘组织中的表达水平检测目的:在椎间盘退行性病变组织中检测miR-424-5p、抗凋亡分子Bcl2、铁死亡抑制基因GPX4和铁死亡促进分子ACSL4的表达情况。方法:本研究应用qRT-PCR技术和Western blotting技术检测退变椎间盘组织中miR-424-5p、Bcl2、GPX4和ACSL4的mRNA和蛋白表达情况。结果:miR-424-5p在退变椎间盘组织中高表达;抗凋亡基因Bcl2在退变椎间盘组织中低表达;铁死亡抑制分子GPX4在退变椎间盘组织中低表达,而铁死亡促进基因ACSL4在退变椎间盘组织中高表达。在椎间盘退行性病变患者的椎间盘髓核组织中,miR-424-5p和抗凋亡基因Bcl2的mRNA表达量显著负相关;在椎间盘退行性病变患者的椎间盘髓核组织中,miR-424-5p和铁死亡抑制分子GPX4的mRNA表达量无显著相关性,而与铁死亡促进基因ACSL4的mRNA表达量显著正相关。结论:miR-424-5p在椎间盘退行性病变组织中表达升高,并且miR-424-5p的表达量与抗凋亡基因Bcl2的mRNA表达量显著负相关,与铁死亡促进分子ACSL4的mRNA表达量正相关。第二部分miR-424-5p通过靶向抑制Bc12促进髓核细胞的凋亡目的:在人髓核细胞中研究miR-424-5p对细胞凋亡的影响。方法:在人髓核细胞中转染miR-424-5p inhibitor沉默其表达,或转染miR-424-5pmimic增加其表达,然后采用qRT-PCR技术检测对Bcl2mRNA水平的影响,采用Western blotting技术检测对Bc12、切割型caspase-3、切割型caspase-9和p62蛋白水平的影响,采用Hoechst染色法检测对细胞凋亡水平的影响,采用MTT法检测对细胞增殖能力的影响,采用荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p与Bc12的3’UTR的结合情况。结果:在髓核细胞中,沉默miR-424-5p抑制细胞的凋亡水平并促进细胞的增殖能力。沉默miR-424-5p上调Bc12的mRNA和蛋白水平,下调切割型caspase-3和caspase-9并上调p62的蛋白表达水平。在髓核细胞中,过表达miR-424-5p促进细胞的凋亡水平并抑制细胞的增殖能力。过表达miR-424-5p下调Bcl2的mRNA和蛋白水平,上调切割型caspase-3和caspase-9并下调p62的蛋白表达水平。miR-424-5p直接结合Bc12的3’UTR。结论:miR-424-5p增加人髓核细胞的凋亡水平,并下调Bc12的表达同时上调切割型caspase-3和caspase-9的水平。第三部分miR-424-5p下调GPX4并上调ACSL4促进髓核细胞铁死亡目的:在人髓核细胞中研究miR-424-5p对细胞铁死亡的影响。方法:在人髓核细胞中转染miR-424-5p inhibitor沉默其表达,或转染miR-424-5p mimic增加其表达,然后采用qRT-PCR技术检测对GPX4和ACSL4的mRNA水平的影响,采用Western blotting技术检测对GPX4和ACSL4的蛋白水平的影响,采用MTT法检测细胞的存活率。结果:过表达miR-424-5p降低髓核细胞的存活率,铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1）和凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）均可以显著回复过表达miR-424-5p引起的髓核细胞存活率降低。过表达miR-424-5p显著下调髓核细胞中GPX4的蛋白水平但不影响其mRNA水平,同时显著上调ACSL4的mRNA和蛋白水平。沉默miR-424-5p显著上调髓核细胞中GPX4的蛋白水平但不影响其mRNA水平,同时显著下调ACSL4的mRNA和蛋白水平。结论:miR-424-5p增加人髓核细胞的铁死亡水平,并下调GPX4的蛋白水平同时上调ACSL4的mRNA和蛋白水平。第四部分过表达miR-424-5p通过上调sp1促进ACSL4的转录诱导髓核细胞的铁死亡目的:在人髓核细胞中研究miR-424-5p上调ACSL4促进细胞铁死亡的调控机制。方法:在人髓核细胞中转染miR-424-5p mimic增加其表达,然后Western blotting技术检测sp1的蛋白水平;在共转染miR-424-5pmimic和sp1 siRNA后,采用qRT-PCR技术和Western blotting技术检测对ACSL4的mRNA和蛋白水平的影响,采用MTT法检测对细胞存活率的影响。结果:过表达miR-424-5p显著上调转录因子sp1的表达。沉默sp1回复过表达miR-424-5p引起的ACSL4的mRNA和蛋白水平升高。沉默sp1部分回复过表达miR-424-5p引起的髓核细胞生存率降低。结论:在人髓核细胞中,miR-424-5p通过sp1上调ACSL4。第五部分体内实验:应用miR-424-5p antagomir治疗兔椎间盘退变目的:应用miR-424-5pantagomir对兔椎间盘退变进行治疗,通过体内实验验证体外实验结果。方法:构建新西兰兔腰椎生物力学失稳模型并注射miR-424-5p antagomir进行治疗。实验过程中应用MRI及病理学对比观察,采用qRT-PCR方法检测组织中 miR-424-5p、Bc12、SLC7A11 和 ACSL4 的 RNA 水平;采用 Western blot 方法检测组织中 cleaved caspase-3、Bcl2、SLC7A11、ACSL4 的蛋白水平。结果:1.MRI显示退变组腰椎手术节段椎间盘T2WI呈低密度信号改变,有黑椎间盘改变。治疗组亦呈低密度信号改变但较实验组信号高,较对照组低。2.病理学观察发现退变组终板细胞层数减少甚至消失,同时出现髓核变性、数量减少及分界不清;治疗组软骨细胞变性,数量减少,髓核细胞大小正常,数量改变不明显。3.治疗组与退变组相比,Bc12和SLC7A11的mRNA表达量显著升高,而ACSL4的mRNA表达量显著降低。4.治疗组与退变模型组相比,Bcl2和SLC7A11的蛋白表达量显著升高,而cleavedcaspase-3和ACSL4的蛋白表达量显著降低。结论:单节段破坏兔椎间后路稳定并施加持续异常应力可导致椎间盘退变;应用miR-424-5p antagomir治疗兔腰椎失稳及异常应力引起的腰椎间盘退变在一定程度上有所改善。