研究背景：　　 肝细胞肝癌是一种高度恶性肿瘤,我国的原发性肝癌病人数占全世界肝癌病人的一半以上。我国乙型肝炎、肝炎后肝硬化病人众多,致使肝癌发病率和死亡率居高不下,其死亡率在中国仅次于肺癌,占所有恶性肿瘤的第二位,且目前缺乏系统而有效的治疗手段。肝细胞肝癌发病的潜在分子机制至今未明。　　 人类众多肿瘤中存在ras基因突变,Ras蛋白分子作为细胞膜上的一个分子开关在细胞信号转导中发挥重要作用。胞外信号通过细胞膜上的各种受体经由Ras蛋白分子介导传到胞内。沉默肿瘤细胞系中ras基因会导致肿瘤细胞的致瘤性减低。Ras基因激活被认为是许多肿瘤发生中的早期事件。因此,ras基因己成为治疗肿瘤的一个靶点,各种针对ras的药物已经面世。Ras在肝癌中高表达,但其在肝癌发病中的机制仍然充满争议。　　 Notch信号是细胞内极为重要的信息交流系统,涉及各种生物学事件,包括维持细胞增殖、分化以及凋亡等生理平衡。部分研究表明Notch信号异常激活促使细胞瘤性增生和恶性转化。在肺癌、宫颈癌、直肠癌、肾癌、淋巴瘤等众多肿瘤中都存在Notch受体、配体以及下游靶基因的紊乱表达。近来,一些实验研究和临床研究表明Notch信号通路参与肝癌的发病。上述现象提示Notch信号通路的失调有可能导致正常细胞癌变。然而,其诱发癌变的确切机制仍然不清楚。　　 越来越多的证据表明Notch信号与Ras信号的共同作用参与了许多肿瘤的发生发展。那么,二者在肝癌发生中是否起协同作用呢?其下游的靶分子又是什么呢?至今无解。　　 猴病毒40因子(Iate semin virus40 factor,LSF),又称作LBP-1c或TFCP2,是一个普遍表达的哺乳动物核转录因子,主要调节胸腺嘧啶核苷合成酶基因,在DNA合成中编码限速酶,调节各种细胞及病毒的启动子。失调的LSF促使细胞进入Gl/S细胞周期,DNA合成增加,刺激细胞转化,有利于癌细胞生存。既然上述两种信号通路均与细胞增殖有关,那么,二者发挥效应是否经LSF介导呢?　　 我们的研究表明Notch信号与Ras协同作用促使肝细胞恶性转化与瘤性增殖,二者共同作用上调核转录因子LSF的表达,促使细胞进入Gl/S周期,二者协同促使肝细胞转化增殖,很有可能在很多情况下起动肝细胞的癌变。我们设计一系列的实验来研究Notch信号与Ras以及LSF在肝细胞癌变中的作用,为弄清肝细胞癌发生机制以及寻找新的治疗肝癌方法提供实验依据。　　 研究目的:　　 研究Notch信号通路,Ras蛋白及核转录因子SV40在肝癌发生中的作用机制　　 研究方法:　　 1.组织标本收集与免疫组织化学:肝癌病人组织标本由南京市第一医院病理科提供2008.1-2010.6期间25例肝癌病人组织蜡块,其中男性20例,女性5例。标本通过HE染色和免疫组化标记诊断肝癌,并依据病理及细胞学证据区分类型。　　 2.细胞系与药物:人肝癌细胞系:HepG2,Bel-7402,QGY-7703购于中科院上海细胞库。人胚肾上皮细胞(HEK),人肝星状细胞(HSC)由本实验室保存,肝细胞系L,02细胞由中国药科大学徐民馈赠。Γ-分泌酶抑制剂DAPT由东南大学卜晓东老师馈赠,用各种浓度的DAPT处理HepG2与L02细胞,以阻断Notch信号的激活。　　 3.构建H-Ras-pEGFP-C1,NICD1-pEGFP-C1,LSF-pEGFP-C1重组载体,然后转染,设立阴性和阳性对照,G418筛选获得稳定转染细胞株。　　 4.蛋白免疫印迹:利用Notch1-ICD(Cell Signaling Technology,MA,USA),LSF(AbcamIncorporation,MA,USA),H-Ras(Oncogene Research Products,CA,USA)andβ-actin(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)等一抗鉴定各重组载体表达蛋白及转染效率。　　 5.荧光素酶报告基因实验:构建LSF-pGL-3重组载体,然后转染,设立阴性和阳性对照,检测荧光数值。　　 6.细胞增殖与活力检测实验:用MTT实验检测转染的HepG2与转化的L02细胞的增殖能力与细胞活性。　　 7.克隆形成实验:评价转染LSF-pEGFP-C1的HepG2细胞与转化的L02细胞的克隆形成能力。　　 8.体内致瘤实验:评价转染LSF-pEGFP-C1的HepG2细胞与转化的L02细胞在裸鼠体内致瘤能力。　　 9.流式细胞试验:LSF-pEGFP-C1/HepG2与转化的L02细胞的细胞周期。　　 10.侵袭实验:评价LSF-pEGFP-C1/HepG2的侵袭能力。　　 结果:　　 1.免疫组化结果显示肝细胞肝癌组织中Ras、Notch-1与LSF蛋白水平与癌旁组织相比显著上调,Ras阳性率:40％,10/25,P＜0.01;Notch-1阳性率:76%,19/25,P＜0.0001以及LSF阳性率:84%,21/25,P＜0.0001。　　 2.HSC和HEK细胞转染外源性的Notch1,激活的Notch信号导致LSF基因和蛋白水平表达上调。激活的Notch信号与突变的Ras蛋白协同作用显著上调LSF的水平。HepG2细胞中激活Notch信号亦能上调LSF基因和蛋白的水平,γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号引起LSF表达水平下调。　　 3.生物学行为试验分析:过表达的LSF在体外刺激HepG2细胞增殖,促使细胞加速进入G1/S期,细胞侵袭能力增加,加速体内肿瘤的生长。　　 4.Notch信号与Ras信号协同作用促使肝细胞恶性转化与增殖　　 5.γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号,减缓Ras转化的L02细胞生长。　　 结论:　　 1.肝细胞肝癌组织中Ras、Notch-1与LSF蛋白水平显著上调。　　 2.突变的Ras分子与失调的Notch信号协同作用促使肝细胞发生恶性转化和瘤性增殖,联合抑制两条通路可能是治疗肝细胞癌新选择。　　 3.过表达的LSF在体外刺激HepG2细胞增殖,促使细胞加速进入细胞周期G1/S,增加细胞侵袭能力,在体内加速肿瘤的生长。　　 4.LSF是Notch信号通路下游的一个关键的调节分子,参与肝细胞肝癌的增殖,侵袭等过程。提示LSF可能是治疗肝细胞肝癌的一个新靶点。