丙型肝炎病毒是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一,每年约有250,000-350,000人死于HCV相关终末期肝病、肝硬化及肝癌。HCV感染对患者的健康和生命危害极大,已成为严重的社会和公共卫生问题,但针对HCV感染的治疗手段有限,目前唯一的治疗手段是干扰素加利巴韦林,而且不能用于失代偿期的患者。迄今为止,还没有可预防HCV感染的疫苗。不能更深入的揭示HCV的发病机制是造成预防与治疗的相对滞后的主要原因之一,因此,进一步探寻HCV致病的分子生物学机制是目前研究的热点问题。丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)是本实验室前期应用酵母双杂交技术从肝细胞cDNA文库中筛选得到的一种与HCV核心蛋白结合的蛋白。且本实验室前期发现, HCBP6蛋白能够上调和下调一系列不同基因的表达水平,这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关。因此有必要对HCBP6进一步深入研究。真核生物的基因表达及调节作用是多水平的调节,其中主要是以转录水平的调节研究较为清楚。转录调控的本质就是蛋白质与DNA或者蛋白质与蛋白质之间的相互作用。丙型肝炎病毒属于RNA病毒,HCV生活周期中并不存在DNA阶段,所以HCV基因组不可能像HBV一样与肝细胞基因组发生整合。由于HCV RNA不与人肝细胞的基因发生整合,病毒蛋白与肝细胞蛋白之间的结合,以及结合所产生的反式调节作用成为发病的主要机制之一。因此,我们对HCBP6的研究从转录水平的调节入手。目的应用生物信息学技术对HCBP6基因启动子上转录因子的结合位点进行预测,并通过缺失等方法进一步验证该启动子活性区域的存在,最后用EMSA实验对该活性区域以及与该区域结合的转录因子进行验证。方法1、从GENEBANK获得HCBP6 (Homo sapiens FUN14 domain containing 2, FUNDC2)的序列,选择转录起始位点上游2000bp至转录起始位点下游300bp,用相关的生物信息学技术对启动子转录活性区域进行预测,初步定位可与转录因子结合的活性区域。2、用PCR的方法扩增HCBP6启动子序列,构建双荧光报告载体,检测其启动子活性,并用截短缺失的方法确定启动子的活性区域。3、用生物信息学技术结合EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验进一步明确对启动子具有调节作用的转录因子。结果1、生物信息学分析表明,HCBP6基因启动子存在着Sp1转录因子结合位点。2、成功扩增了HCBP6基因启动子片段,构建了HCBP6基因启动子序列双荧光报告载体。获得了具有较高启动子活性的HCBP6基因启动子序列。3、EMSA分析证明HCBP6基因启动子序列上Sp1转录因子结合位点能够与核蛋白特异性结合,表明该位点确实为转录因子Sp1的结合位点。结论确定了HCBP6的一个转录活性区,确定Sp1对HCBP6具有转录调节作用。