研究背景针刺是在中医经络理论指导下的一种重要的治疗方法,一直被视为一种安全可靠、疗效确切及毒副作用小的“绿色”治疗方式。长期以来,以毫针为代表的多种针具在临床被广泛应用于慢性软组织损伤类疾病的临床康复治疗,并取得很好的临床疗效。近几十年来,在毫针基础上研发的各种新型针具不断涌现,并被广泛应用于治疗劳损性肌筋膜炎及慢性软组织损伤类疾病。然而有关新型针具的相关基础研究却未能齐头并进。新型针具相关基础研究十分薄弱,且这些针具的具体治疗机制尚不明确。目前,基于《灵枢·刺节真邪》“一经上实下虚而不通者,此必有横络盛加于大经,令之不通,视而泻之。此所谓解结也。”的文献记载,在介绍其治疗机制时,多是以松解局部软组织粘连和疏通经络来阐述其作用机制。而使用针具实施局部软组织松解作为一种有创性和侵入性治疗方式,目前尚无相关研究探讨和观察这些新型针具局部松解治疗是否对松解局部组织造成损伤及松解后局部组织的病理变化。因此,明确使用这些针具进行局部松解治疗后局部组织的组织形态变化及病理变化转归十分重要。故本课题选用小针刀、刃针、铍针、松筋针、银质针及长圆针6种常用针具开展动物实验研究,以为新型针具临床使用提供组织形态学及病理学依据。研究目的1.在大体水平,肉眼观察使用小针刀、刃针、铍针、松筋针、银质针及长圆针6种常用针具模拟实施局部松解对大鼠松解局部肌组织的影响;2.在组织水平,光镜与电镜下观察使用以上6种针具模拟实施松解对大鼠松解局部肌肉组织形态及超微结构的影响;3.在组织水平,光镜与电镜下观察使用以上6种针具模拟实施松解后不同时期松解局部组织的病理变化及转归。研究方法1.动物分组与操作:将108只健康雄性SD大鼠平均分为松筋针组、银质针组、长圆针组、小针刀组、刃针组及铍针组6组,每组18只。正常饲养,恒温、恒湿,自由饮水、饮食。适应性饲养1周后,腹腔注射3%戊巴比妥钠(50mg/kg质量)麻醉,仰卧位固定于操作台,去毛、备皮、消毒。术者分别参照松筋针、银质针、长圆针、小针刀、刃针及铍针人体松解操作方法,于大鼠两侧腓肠肌肌腹中部同一部位实施模拟松解(刺入深度0.5～0.8cm,松解2～3次),操作时要求术者松解力度、范围及时间尽量保持相同,术毕用无菌棉球按压术区2～3 min,无菌创可贴包扎。此外,松筋针组、银质针组、小针刀组及铍针组各预留1只大鼠实施局部松解大体观察。2.实施大体观察:松筋针组、银质针组、小针刀组及铍针组每组各取1只实验大鼠麻醉后,打开胸腔,暴露心脏;将灌注针从左心室前壁刺入到左心室,用生理盐水灌注,同时剪开右心耳,让生理盐水从右心耳流出,肝脏变白则停止。换用4%多聚甲醛固定液进行灌注内固定,待后肢变硬后,选用松筋针、银质针、小针刀及铍针4种针具于大鼠腓肠肌肌腹实中部模拟施松解干预。出针后肉眼观察局部损伤情况,并用数码相机拍照记录;余各组大鼠分别于干预后第3天、7天及15天时腹腔注射3%戊巴比妥钠(50mg/kg质量)麻醉后,无菌条件下打开术区皮肤,解剖显微镜和肉眼大体观察各时间点局部组织形态变化并用数码相机拍照记录。3.组织形态及病理变化观察:每组大鼠分别于干预后3天、7天、14天、21天及30天过量麻醉处死。解剖分离腓肠肌,并于低温下快速切取干预部位肌组织1～2cm,经生理盐水漂洗干净后,投入4%多聚甲醛固定液中,4℃条件下固定24小时以上。经梯度酒精脱水,二甲苯透明后,石蜡包埋,4μm连续切片。分别进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)、Mallory三色染色(Mallory trichrome staining)及Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白免疫组化染色(Immunohistochemical staining)。光镜下观察松解后局部肌组织的组织形态及病理变化过程。采用cellSens-Entry1.15软件采集图像(tiff格式),使用Image Pro-Plus 6.0图像分析软件分析处理所有图片并计算较远纤维相对面积和Ⅰ/Ⅲ型胶原积分吸光度值(intensive optical density,IOD)。并进行炎性细胞计数、成纤维细胞计数和微血管密度(microvesseldensity,MVD)计数分析。4.透射电镜超微结构观察:每组解剖分离腓肠肌后,低温下迅速至于PBS缓冲液中漂洗2～3次,低温条件下将漂洗后的组织切成2mm×2mm长条状,迅速投入盛2.5%戊二醛固定液的培养皿中1～2分钟。待组织稍固定后,将其切为1mm3大小的组织块投入2.5%戊二醛固定液4℃下固定4小时。超薄切片,醋酸铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜下观察松解局部肌组织超微结构改变。研究结果1.大体观察:肉眼大体观察可见带刃型针具针刺局部出血较多,渗血持久;圆钝型针具针刺局部基本无出血,渗出较少。这可能与针具的锋利程度有一定的关系。生理盐水与多聚甲醛灌注后针刺,出针后可见局部存在不同程度的空洞样创区。针刺后第3天,打开针刺部位皮肤,肉眼可见针刺局部不同程度的细胞外分泌物堆积,解剖镜下可见局部胶原纤维与皮部粘连。第7天时肉眼可见针刺局部创区分泌物增多,高于局部组织平面。第15天,可见创区局部分泌物基本吸收,解剖镜下可见仅有少量纤维与局部皮肤粘连。2.组织形态及病理变化观察:HE染色、Mallory三色染色后,光镜下局部组织形态及病理变化观察:干预后第3天,光镜下可见肌纤维溶解、坏死及炎性细胞浸润;第7天,炎性细胞减少,成纤维细胞增殖,肉芽组织增生;第14天,局部胶原堆积伴肉芽组织大量形成;第21天,胶原减少,肉芽组织机化;第30天,光镜见局部组织瘢痕化。Mallory染色可见,干预后局部胶原纤维呈现从形成至增加,再逐渐缓慢下降趋势变化趋势与HE染色观察结果基本一致。胶原相对面积比较,不同时间、不同直径和类型针具差异均有统计学意义(P<0.01);针具类型与直径之间存在交互作用(P<0.01)。3.免疫组化染色观察:免疫组化染色可见干预后各时期松解局部均存在I/III型胶原纤维,I/III型胶原着色区域显示为棕黄色,I其在局部瘢痕早期分泌量较多后期沉积较多,而III型胶原纤维逐渐减少,最后表现为I/III型胶原比例倒置。两类针具干预后,MVD、成纤维细胞计数及IOD值变化呈现先增加后逐渐下降趋势,第7d达到峰值,其后逐渐下降。同一时间,同类针具不同直径间MVD比较差异均有统计学意义(P<0.01),同类针具不同直径间成纤维细胞计数比较差异均有统计学意义(P<0.01),同类针具不同直径间IOD值比较差异均有统计学意义(P<0.01);同一针具不同时间点间MVD比较差异有统计学意义(P<0.01),同一针具不同时间点间成纤维细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.01),同一针具不同时间点间IOD值比较差异有统计学意义(P<0.01)。4.电镜观察:正常骨骼肌肌纤维排列整齐,Z线清晰,线粒体分布均匀,排列规则。长圆与刃针干预后3小时,电镜下可见部分肌原纤维紊乱、断裂、溶解,Z线模糊不清,线粒体肿胀及空腔化,线粒体嵴变短或消失;第3天,两组均可见活化的肌卫星细胞,细胞质一极或两极形成细胞质突起和延伸。细胞核周围有许多肌丝形成,提示损伤的肌原纤维进行修复;第30天,可见肌原纤维溶解灶及溶酶体,间质中尚有成纤维细胞且胶原纤维大量增生。结论1.大体观察表明,这些针具对局部肌组织有一定的损伤性;带刃型针具较圆钝形针具更易损伤局小血管及神经组织。2.镜下观察表明,这些针具对局部组织有一定的损伤效应,损伤后局部组织尚不能完全修复而瘢痕化;统计分析表明,针具类型与直径均是其损伤效应的决定因素;同类型针具,直径较大者其损伤效应更加明显;相同直径的针具,圆钝型针具损伤性大于带刃型。3.病理变化观察,这些针具局部松解干预后,局部肌纤维断裂、溶解及坏死;产生异常炎性反应,成纤维细胞活化,增殖活跃及胶原蛋白等过度分泌,最终导致局部组织不可逆性损伤。4.基于以上结论,临床治疗时应避免选择直径较大针具实施局部松解治疗,以免造成局部组织不可逆性损伤;其次,同一部位应避免短期内反复实施松解,反复松解可导致局部持续性炎症反应导致局部组织纤维化。